分子影像學(xué)與干細胞移植活體示蹤的研究進展

作者：馮銘 王任直    作者單位：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院-中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)外科， 北京 100730

【摘要】  近年來，干細胞在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、血液病和心臟疾病治療中獲得廣泛應(yīng)用。干細胞移植后，活體示蹤干細胞的存活和遷徙具有重要意義。分子影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展使干細胞活體示蹤成為可能，光學(xué)成像、磁共振成像、單光子發(fā)射計算機斷層顯像、正電子發(fā)射計算機斷層顯像是臨床和實驗中常用的分子影像學(xué)方法，具有各自的優(yōu)勢和缺點。本文即對以上成像方法在干細胞活體示蹤方面的研究進展及應(yīng)用前景予以綜述。

【關(guān)鍵詞】  分子影像學(xué) 干細胞移植 熒光抗體技術(shù)

　　干細胞是具有自我更新和多向分化潛能的細胞，對腦血管病、神經(jīng)退行性病、血液病、缺血性心肌病等有著廣闊的應(yīng)用前景。分子影像學(xué)的發(fā)展使在活體狀態(tài)下示蹤移植細胞的存活、遷徙成為現(xiàn)實。
　　     
　　Weissleder[1]于1999年提出分子影像學(xué)概念，即在細胞和分子水平活體評價生物過程，包括體內(nèi)示蹤細胞的存活、遷徙。目前，分子影像學(xué)用于干細胞活體示蹤的技術(shù)主要包括光學(xué)成像、磁共振成像、核醫(yī)學(xué)成像，后者主要包括單光子發(fā)射計算機斷層顯像 （single photon emission computed tomography，SPECT） 和正電子發(fā)射計算機斷層顯像 （positron emission tomography，PET）。

　　1    光學(xué)成像
       
　　檢測活體動物體內(nèi)基因表達及細胞活動的光學(xué)成像技術(shù)具有操作簡便、直觀性強的優(yōu)點，其關(guān)鍵是設(shè)計生物相容性好的近紅外熒光染料，研制特異性影像探針，合成可激發(fā)的生物發(fā)光蛋白[2]。光學(xué)成像包括生物發(fā)光成像和熒光成像，前者利用動物體內(nèi)的自發(fā)熒光，不需要激發(fā)光源；后者需要外界激發(fā)光源。

　　1.1    生物發(fā)光成像    生物發(fā)光技術(shù)采用熒光素酶基因標記干細胞或DNA， 靠酶和底物的特異作用而發(fā)光。由于動物體自身不會發(fā)光，故生物發(fā)光背景極低，從動物體表的信號水平可直接得出發(fā)光細胞的數(shù)量。Maxwell等[3]用熒光基團結(jié)合的氧化鐵納米顆粒標記造血干細胞，進行熒光成像；與流式細胞計數(shù)結(jié)合，可以評價干細胞標記效率和歸巢能力。Rosen等[4]采用納米熒光探針標記間充質(zhì)干細胞，植入哺乳動物心臟，結(jié)果8周后仍可看到移植細胞。

　　1.2    熒光成像    熒光技術(shù)采用熒光報告基因，如綠色熒光蛋白 （GFP） 等熒光染料對干細胞進行標記，報告基因、熒光染料受到激發(fā)即可產(chǎn)生熒光。熒光成像的波長范圍為400～900 nm，常見熒光材料具有不同的波長范圍可供選擇[5]。這種技術(shù)較生物發(fā)光操作簡單，無需注入底物，發(fā)光強度高。但生物體內(nèi)許多物質(zhì)在受到激發(fā)光激發(fā)后，會產(chǎn)生較強的自發(fā)熒光，以至?xí)�嚴重影響檢測的靈敏度，特別是當發(fā)光細胞位于組織內(nèi)部時，背景底色會很高。該技術(shù)的主要優(yōu)點是無輻射，可進行連續(xù)、實時監(jiān)測，靈敏度、分辨率較高，而花費相對較低。光的穿透能力很有限，僅為數(shù)毫米到數(shù)厘米，因此，熒光成像多用于小動物的實驗研究。另外，由于散射等原因，其空間定位能力較差。

　　2    磁共振成像
       
　　MRI是最常用的成像方法，由于有效成像時間長，可觀察細胞的動態(tài)遷徙過程，空間、時間分辨率高，對比度好，因此，其前景看好。
　　     
　　MRI主要依賴縱向 （T1）、橫向 （T2） 弛豫時間及使用對比劑前后弛豫時間的差別來診斷。常用的對比劑有兩種：一種是釓類 （Gd3+），T1WI為高信號，也稱陽性對比劑；另一種為超順磁性對比劑，如SPIO （superpara-maganetic iron oxide） 和USPIO （ultra- small superparamagnetic iron oxide），T2WI和T2*WI （對鐵顆粒敏感） 為明顯的低信號，稱陰性對比劑。Gd3+標記的細胞只能在移植后1周內(nèi)檢測到，不能用來長期監(jiān)測細胞的存活及遷徙[6]。而SPIO在體內(nèi)更穩(wěn)定，也能提供更好的對比度；居勝紅等[7]采用國產(chǎn)的磁性納米粒子標記人臍血間充質(zhì)干細胞，獲得了滿意的結(jié)果。單純應(yīng)用SPIO標記干細胞效率較低， 而通過轉(zhuǎn)染劑可顯著提高標記效率。常用轉(zhuǎn)染劑包括魚精蛋白 （PRO）、多聚賴氨酸 （PLL）、繁枝體大分子化合物 （Dendrimer） 等；其中以陽離子轉(zhuǎn)染劑PLL應(yīng)用最多，其通過電荷吸附作用結(jié)合SPIO，可以有效地被內(nèi)涵體吞噬。菲立磁 （Feridex-PLL） 對間充質(zhì)干細胞的活力和增殖能力無影響[8]，但可抑制干細胞向軟骨方向分化[9]，而向脂肪和骨方向的分化不受影響。
　　     
　　目前，磁共振可以檢測到很少量的細胞甚至單細胞[10]。Hoehn等[11]采用USPIO標記大鼠胚胎干細胞，植入大鼠腦缺血對側(cè)的皮質(zhì)下及紋狀體，數(shù)天后，MRI顯示出移植細胞向缺血區(qū)域移行的路徑。魏俊吉等[12]將標記Feridex的人骨髓基質(zhì)干細胞 （hBMSC） 植入腦缺血大鼠的同側(cè)及對側(cè)腦實質(zhì)內(nèi)，MRI顯示移植后第14天，缺血同側(cè)移植組hBMSC向缺血灶邊緣遷移，缺血對側(cè)hBMSC沿胼胝體彌散。Ju等[13]采用SPIO標記鼠BMSC，植入鼠肝損害模型，MRI可活體觀察到移植細胞，組織學(xué)檢查證實肝臟內(nèi)有存活的BMSC。
　　     
　　用SPIO標記干細胞具有許多優(yōu)勢：信號對比度好，尤其在T2WI和T2*WI；對比劑由可生物降解的鐵組成，分解后參與鐵代謝，可被機體再利用；核心層外包被葡聚糖，可直接結(jié)合各種功能性基團；很容易用光鏡或電鏡觀察到；通過改變顆粒的大小，可以調(diào)整其磁效應(yīng)。但SPIO的應(yīng)用也有一些限制：鐵顆粒會引起信號的丟失，產(chǎn)生所謂的黑洞效應(yīng)，直接影響MRI相關(guān)解剖結(jié)構(gòu)的顯示，不能區(qū)分移植細胞和人工植入物造成的磁敏感性偽影；細胞所攜帶的非遺傳物質(zhì)會逐漸減少，被排出細胞外并被其他細胞攝取。目前的研究結(jié)果表明：至少在移植后18周內(nèi)，可以通過MRI檢測到標記的細胞[14]。

　　3   核醫(yī)學(xué)顯像
　　     
　　SPECT和PET為核素示蹤的顯像技術(shù)。PET的顯像原理決定了它較SPECT具有更高的空間分辨率和敏感性，其在神經(jīng)系統(tǒng)中應(yīng)用最廣泛[15]。SPECT掃描需要準直器，只能檢測到身體發(fā)射的小部分γ-射線，影響其敏感性；另外，散射也降低了它的空間分辨率[16]。
　　     
　　各種組織或細胞均有特異或相對特異的分子標志物，利用適當?shù)姆派湫院怂貥擞涍@些特異性標志物來作為探針，能夠在活體顯示組織、細胞的存在和狀態(tài)。根據(jù)感興趣分子與探針的不同，核醫(yī)學(xué)顯像可以分為代謝顯像、抗體顯像、受體顯像、報告基因顯像和反義顯像。

　　3.1    代謝顯像    其在臨床科研中應(yīng)用較多。最常用的分子探針是組織和細胞的代謝底物或類似物。如氟-18-脫氧葡萄糖 （18F-FDG） 是葡萄糖的類似物，被細胞攝取后在己糖激酶的作用下完成磷酸化，然后停留在細胞內(nèi)濃聚而不再參于代謝。18F-FDG掃描可反映葡萄糖的代謝情況，從而間接反映疾病的狀況[17]。Hofmann等[18]研究18F-FDG標記的BMSC在心肌梗死病人心肌中的歸巢情況，結(jié)果在心肌梗死區(qū)域 （主要是心肌梗死邊緣） 發(fā)現(xiàn)了移植細胞。由于葡萄糖和氨基酸代謝是多通路、多分子調(diào)節(jié)的，故利用代謝顯像示蹤干細胞增殖的特異性較低。Doyle等[17]利用18F-FDG 標記前體細胞，通過冠狀動脈移植治療心肌梗死，利用PET或CT可動態(tài)觀察到細胞存活情況。Stelljes等[19]利用18F-FDG-PET做為一種敏感、無創(chuàng)的檢查方法來檢測移植物抗宿主病 （GVHD）。

　　3.2    抗體顯像    抗體顯像是利用抗原、抗體的特異結(jié)合，將抗體作為探針，以檢測細胞表面抗原的存在。這一技術(shù)的關(guān)鍵是獲得同源性抗體，并構(gòu)造分子量小、呈脂溶性的抗體。

　　3.3    受體顯像    受體顯像是將放射性標記配基引入體內(nèi)，與特異性受體結(jié)合，從而顯示受體作用的部位。受體顯像最有可能首先進入干細胞活體示蹤領(lǐng)域。神經(jīng)受體顯像劑有相對成熟的藥物或藥物衍生物作為標記底物。國內(nèi)研究者用11C-raclopride與D2受體結(jié)合，進行PET顯像，在神經(jīng)前體細胞的移植部位看到了明顯的放射性濃聚[20]。

　　3.4    報告基因顯像    報告基因顯像將報告基因 （如GFP） 與靶基因耦聯(lián)，通過測定表型蛋白，間接反映靶基因的表達。一種報告基因可以與多種靶基因耦聯(lián)，一個報告基因系統(tǒng)能用于多種基因顯像。但必須在體外將報告基因與靶基因耦聯(lián)，然后用載體導(dǎo)入動物或人體內(nèi)。

　　3.5    反義顯像    反義顯像通過螯合劑將核素與反義寡核苷酸連接，在細胞內(nèi)與靶基因的mRNA互補結(jié)合，從而顯像，可反映目標DNA的轉(zhuǎn)錄情況。雖然這種技術(shù)尚未成熟，但其可能是徹底解決干細胞活體示蹤技術(shù)的最終途徑。
　　     
　　利用PET示蹤干細胞，在靈敏度、定量分析方面具有較大的優(yōu)勢，并已在干細胞移植治療帕金森病研究中獲得了很好的效果。但是，目前核醫(yī)學(xué)顯像仍不能完全解決干細胞活體示蹤的問題，其主要原因是缺乏特異性干細胞標記物。隨著干細胞特異性標記物的發(fā)現(xiàn)及分子探針技術(shù)的發(fā)展，PET將成為最有前途的示蹤干細胞的分子影像學(xué)技術(shù)。