利用ImageXpress Micro進行長時間活細胞成像和心肌細胞功能評價
利用ImageXpress Micro進行長時間活細胞成像和心肌細胞功能評價
活細胞成像技術是最近幾年興起的一項技術，能夠在細胞接近生理的狀態(tài)下觀察細胞形態(tài)改變和蛋白的表達，該技術能夠避免傳統(tǒng)采用固定細胞或組織的研究方法中，固定細胞過程中造成的細胞形態(tài)的改變和結構改變，能夠更加真實的反映出細胞的特性，因而廣受推崇。MD ImageXpress Micro高內涵系統(tǒng)具有多種特性能夠進行長達數(shù)天的活細胞的觀察，同時，由于采用著名的MD軟件產品MetaMorph為基礎的MetaXpress高內涵分析軟件，具有極高的靈活性和擴展能力，除活細胞成像之外還能夠能夠對某些細胞（如心肌細胞）的生理藥理特性進行評價。
神經細胞長時間成像
神經細胞是公認的較為敏感和脆弱的細胞，對于外界環(huán)境較為敏感。對于活的神經細胞的長時間培養(yǎng)和觀察具有較大困難。采用ImageXpress Micro系統(tǒng)能夠實現(xiàn)神經細胞的長時間觀察培養(yǎng)。
方法：
從新生大鼠大腦海馬獲得約1立方毫米大小組織塊。移入含有0.25%胰酶的離心管中37℃，5%CO2 孵育箱內消化20～30 min。加入含胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，離心重懸細胞，按0.6×105/ml 鋪于96 孔板中。24 h 后換為NeurolbasalMedium/B27 無血清培養(yǎng)液，以后每2~3 d 半量換液1 次。7 d 后獲得原代神經細胞。
圖像獲取：
將樣品放入有環(huán)境控制功能的MD ImageXpress Micro高內涵系統(tǒng)內，采用激光自動聚焦進行樣品聚焦，在10X物鏡下每隔5分鐘進行一次相差圖像拍攝，結果如下：
小結：
ImageXpress Micro采用的環(huán)境控制系統(tǒng)能夠維持細胞所需的溫度、濕度和CO2條件，其中溫度為細胞的酶活性提供了溫度保障，確保細胞的生理機能，濕度維持能夠保證細胞外液不會蒸發(fā)，避免了胞外滲透壓的升高造成的細胞脫水，CO2能夠維持細胞外液的pH值。
除了維持細胞的生存環(huán)境外，在進行敏感、脆弱細胞（如神經細胞）的長時間觀察過程中，最為重要的是減小對細胞的刺激，盡可能的保持細胞的活性。ImageXpress Micro采用激光自動聚焦技術，在聚焦的過程中，細胞無需受到光照，這樣就避免了細胞內的光化學反應和光照升溫，能夠很好的維持細胞的活性狀態(tài)。因此，在長時間活細胞的觀察過程中，以上兩點不可或缺。
心肌干細胞細胞的功能評價
ImageXpress Micro采用的軟件系統(tǒng)功能強大，具有無限的擴展功能。因此，除了能夠實現(xiàn)活細胞的長時間觀察和細胞的形態(tài)、蛋白表達等分析，ImageXpress Micro還能夠實現(xiàn)細胞功能學的評價。
干細胞研究是目前生物學研究的熱點，采用人類的干細胞（如心肌干細胞）能夠加快研究的速度，同時還能夠真實反映人體細胞的功能，還能加快藥物進入臨床的速度。iPS來源的心肌細胞因其表達的離子通道、自發(fā)節(jié)律特性、與原代心肌細胞特性相似的特性尤其引人注目，通過該細胞可以進行心肌細胞特性的研究，并能縮短藥物篩選的時間與臨床前實驗的周期。
方法：
采用Cellular Dynamics公司的iPS來源的心肌細胞，將其鋪于96孔板，并在培養(yǎng)液中孵育2-7天，以Calcein AM孵育10分鐘，將培養(yǎng)液棄去后，加入不同濃度的激動劑和抑制劑。
圖像獲取和結果：
心肌細胞的成熟狀況要通過細胞自發(fā)的節(jié)律性收縮來進行判定。細胞的節(jié)律性收縮可以通過電生理的方法進行檢測。但是電生理的方法相對較復雜，因此我們采用熒光圖像的自動分析來取代。
首先采用延時拍攝或實時拍攝的方法我們可以獲得細胞節(jié)律性收縮的一組圖像，
MetaXpress對心肌細胞跳動進行自動分析
圖3. 將獲得的心肌細胞跳動的一組圖像生成圖像堆棧，采用Journal擴展獲得的功能模塊自動分析相鄰兩個時間點圖像的差別，一次來判定心肌細胞的跳動頻率和幅度，采用功能模塊中的計數(shù)器自動計算心肌跳動的頻率和幅度。在Journal擴展的功能模塊中以上功能自動完成，并直接報告心肌細胞跳動頻率和幅度信息
心肌跳動模式檢測
我們采用經典陽性藥物異丙腎上腺素、腎上腺素、咖啡因作為刺激劑，用已知的心肌細胞抑制劑乙酰膽堿來進行心肌跳動模式的檢測和心肌跳動分析模塊的功能。
四種藥物不同濃度作用下心肌細胞跳動頻率的變化。細胞自發(fā)跳動節(jié)律各有不同，通常為20-40次/分鐘。給藥后的5-60分鐘內，心肌跳動頻率穩(wěn)定，因此以上均為給藥后10分鐘檢測結果。
小結：
ImageXpress Micro采用的高度靈活的系統(tǒng)能夠對心肌細胞進行自動成像，其采用的MetaXpress軟件具有極高的靈活性，其具有的Journal功能能夠根據(jù)圖像和實驗要求進行隨意的擴展，除了進行心肌細胞生理學評價之外，還能進行超過1000個功能的擴展。
