Lavision雙光子顯微鏡-毛囊再生過程活體成像

Panteleimon Rompolas1, Elizabeth R. Deschene1*, Giovanni Zito1*, David G. Gonzalez2, Ichiko Saotome1, Ann M. Haberman2& Valentina Greco1

1Department of Genetics, Department of Dermatology, Yale Stem Cell Center, Yale Cancer Center, Yale School of Medicine, New Haven, Connecticut 06510, USA.

 2Department of Laboratory Medicine, Yale School of Medicine, New Haven, Connecticut 06510, USA.

 

摘要  組織的發(fā)生與再生依賴于細胞-細胞間相互作用和指向干細胞的信號以及它們的直接增殖。但是，引導組織適當再生的細胞行為還沒有被很好的理解。運用一種新的，非侵入的雙光子成像技術(shù)，我們研究了活鼠隨時間推移的生理性毛囊再生。通過這種方法，我們監(jiān)測了真皮層干細胞和它們的后代在生理性毛囊再生過程中的行為，并指出了間充質(zhì)對它們行為的影響。承接早先的研究，干細胞在毛發(fā)再生的初始階段處于靜止狀態(tài)而它們的后代處于更活躍的分生狀態(tài)。除了細胞分化之外，后代細胞的協(xié)調(diào)運動也允許毛囊的快速擴張。最后，我們通過切蝕目標細胞的和長時間跟蹤活毛囊展示了間充質(zhì)對毛發(fā)再生的要求。因此，我們建立了一種直接原位觀察毛囊內(nèi)生長調(diào)控的細胞機制的方法，這使得我們可以精確調(diào)查生理性再生過程對毛囊組分的功能性要求。

 

    在原位成像中，對3周齡的小鼠通過腹膜內(nèi)注射克他命和甲苯噻嗪進行麻醉，頭部區(qū)域的皮膚使用機械剪毛器和脫毛膏剃光。小鼠被放在一個加熱平臺上，頭部和耳朵通過一個自制固定臺固定。一個玻璃蓋被放在頭耳結(jié)合部的皮膚上。皮膚的圖像棧通過一臺裝配Chameleon Vision II (Coherent)雙光子激光器的LaVision TriM II Scope（LaVision Biotech產(chǎn)品）顯微鏡獲取。一束激光(at 940 nm for GFP and 1040 nm for RFP, respectively)通過aX20水浸物鏡（(N.A. 1.0; Olympus)聚焦并以600Hz的頻率掃描0.25到0.5mm2的視野區(qū)域。系列光學切片在5分鐘內(nèi)以步長2-3µm成像總深度100µm的組織。從靜止階段向生長階段轉(zhuǎn)變的幾個相（靜止相到生長初期相）被分析。在皮膚里使用不同的內(nèi)在標記以在不同試驗中定位到視野的初始區(qū)域并觀察同一個毛囊。實驗過程中通過鼻尖吸入氣化異氟醚保持麻醉狀態(tài)。

 

    三維雙光子激光切蝕。使用同樣的光學設(shè)備進行激光切蝕。使用900nm的激光束掃描一個10µm2的區(qū)域，以25%的激光能量持續(xù)1秒鐘即可獲得切蝕。根據(jù)目標深度(30–80 µm)調(diào)整切蝕參數(shù)。

 

Figure 1 | 新的一次生長開始，細胞分化是在毛囊中進行空間調(diào)控的。a,靜止狀態(tài)毛囊。參與毛發(fā)再生的不同細胞群，包括干細胞，progeny和間充質(zhì)，存在于定義的毛囊解剖隔層中。 b, 來源于雙光子激光掃描顯微鏡系列光學切片的靜止態(tài)活毛囊的三維重構(gòu)。上皮細胞核（綠色）通過角蛋白14啟動子(K14H2BGFP)驅(qū)動的H2B-GFP融合蛋白顯影。 c, 一個progeny 分裂的例子。一個活毛囊的單獨光學切片（左側(cè)）和progeny 組分中三個處于有絲分裂期間細胞核的放大圖（右側(cè)，插圖）。 d, 從幾個處于早期生長階段毛囊(n=17)中定量化細胞分裂的位置和軸 (生長初期 II)。e,垂直（左圖）和水平（右圖）方向干細胞分裂的兩個例子。一個活毛囊的單獨的光學切片（左側(cè)插圖）和處于有絲分裂中的干細胞隔層（右側(cè)插圖）的細胞核放大圖。紅色箭頭，有絲分裂中的親代核與子代核。圖片的時間推移分別為15分鐘和45分鐘。標尺20 µm.

Figure 2 |生長過程中處于形態(tài)重組的干細胞progeny隔層. a, 毛囊生長中的向下伸展。生長狀態(tài)的活毛囊三個連續(xù)時間點（3小時間隔）的光學切片，展示了progeny組分向下的伸展（左三） 。核間距增加，干細胞和progen隔層(大約生長初期 II to IIIa)中的總細胞數(shù)被定量。 (右側(cè), 數(shù)據(jù)表示為mean±s.e.m. (n=13–20; asterisk, P< 0.0001) b,毛囊內(nèi)的核重組.兩個光學切片（左側(cè)）分別跟蹤和測量了同一毛囊在0時刻和4h時的（右側(cè)）冠面和切面（xy and xz）（大約生長初期II to IIIa）（底圖）。c, 生長中毛囊的向下遷移。單一光學切片表明了單個毛囊在1小時間隔連續(xù)時間點的完整的（左側(cè)）和下部局部視圖（上側(cè)）。光學切片中的紅色箭頭和相應的跟蹤標記了一個正在向下移動的核，5h內(nèi)走過了30µm（大約生長初期IIIb）。在0h所展示的綠色核的位置以灰色表示用來比較（右下方圖）。標尺20µm

Figure 3 | 間充質(zhì)皮膚乳頭的切蝕削弱了毛發(fā)再生的啟動. a, 實驗設(shè)計，使用激光誘導皮膚乳頭細胞切蝕來測試間充質(zhì)對毛發(fā)再生的要求。b, 切蝕皮膚乳頭細胞的活毛囊四個時間點的高放大率光學切片。c,包含少數(shù)切蝕皮膚乳頭細胞的活毛囊的一群毛囊（黃色箭頭）在三個時間點的低放大率光學切片。d,兩個progeny被部分切蝕的毛囊在3個時間點的低放大率光學切片。e,切蝕皮膚乳頭（上）或部分切蝕progeny隔層（下）的毛囊（作為毛囊的總長度測量）生長與對照完整毛囊的量化比較。數(shù)據(jù)表示為mean±s.e.m. (n=8–10; asterisk, P< 0.0001).標尺50 µm.

Figure 4 | 毛囊再生的細胞機制。毛發(fā)再生的初始階段，干細胞progeny是啟動增殖的隔層。雖然分化數(shù)量少于干細胞progeny，但是隆突內(nèi)部也檢測到了細胞的分化。子代隔層是沿毛囊生長的軸向分化，而隆突內(nèi)的分化方向則是隨機的。毛囊經(jīng)歷了一個向下的延伸，其中子代內(nèi)而不是干細胞隔層內(nèi)的核間距增加。圍繞間充質(zhì)皮膚乳頭的上皮細胞核重新排列并圍繞間充質(zhì)壓縮。間充質(zhì)的切蝕導致了毛囊生長的減弱。