神經干細胞移植對缺氧缺血新生大鼠感覺運動機能的影響

【摘要】 目的 研究神經干細胞 (NSCs)移植對改善新生大鼠缺氧缺血性腦損傷 (H I BD)后感覺運動障礙的作用。

方法  7d齡新生SD大鼠,隨機分為假手術組, HIBD組和腦內移植組 ,后兩組 H I BD損傷后3 d分別在左側感覺運動皮質區(qū)植入BrdU標記的 NSCs或培養(yǎng)基作為對照 ,觀察植入 4周后大鼠感覺運動功能的變化和移植細胞在腦內的存活和分化情況。結果 與 H I BD組比較 ,移植組在 T迷宮和四項感覺運動功能測試中,表現出明顯的改善。在T迷宮中,自發(fā)改變率(69.23±13.34) % vs (45.00±27.27)%] (P<0.05)上升;在握持牽引試驗中 ,握持時間明顯延長 [ (49.15±13.39) s vs (27.20±15.18) s ] ( P <0.05) ;在肢體放置和足錯誤試驗中的不對稱性消失 ,姿勢反射也明顯改善 ( P < 0 . 05 )。BrdU間接免疫熒光顯示移植后 4周 ,在腦內可見存活的 NSCs分布于移植點附近; BrdU和 NF2 200免疫熒光雙標顯示移植后4周 NSCs可部分分化為神經元表達 NF2 200。 結論 腦內移植 NSCs對 H I BD新生大鼠的感覺運動機能和行為的恢復有良好的促進作用。

【關鍵詞 】 神經干細胞; 移植; 感覺運動; 缺氧缺血; 大鼠

新生兒缺氧缺血性腦病 (H IE)的病死率高 ,預后差,可產生永久性神經功能障礙。目前對新生兒 H IE的治療僅局限于支持療法 ,尚無促進神經再生的手段[ 1 ]。目前 ,在使用神經干細胞 (NSCs)移植治療缺氧缺血性腦損傷 (H I BD)的動物實驗和臨床實驗中,均已取得了一定的療效[2]。但是這些研究結果大多來自于成年動物和成年人,NSCs移植能否改善新生大鼠HIBD后的感覺運動障礙尚未見報道。本研究探討腦內移植胚鼠 NSCs對新生大鼠 H I BD后感覺運動功能的影響。

SD大鼠 (清潔級)。DMEM /F12 ( 1: 1 )、 B27 ( Gibco ) , bFGF、EGF ( Pep r oTech EC)�？� NF2 200、 抗 B rdU (NeoMarkers)。大鼠腦立體定位儀, T迷宮、 常壓缺氧艙均為參照文獻自制。

取孕 14 d S D大鼠的胚胎 ,分離前腦皮質組織 ,胰酶消化吹打制成單細胞懸液后接種于含 10 ng/mlbFGF和 20 ng/ml EGF的 DMEM /F12培養(yǎng)基 (另含 B2720μl /ml)中培養(yǎng) ,每 2～3 d半量換液 1次。移植前3 d,將準備移植的 NSCS換液 ,同時在培養(yǎng)基內加入 B r2dU孵育 ,終濃度為 10μmol /L。收集在體外穩(wěn)定傳代培養(yǎng) 1月并經 BrdU標記的 NSCs備移植用。4%臺盼藍染色細胞計數 ,活細胞 > 95% ,調整活細胞密度為 5×104個細胞 /μl,置冰上備用。

新生7d齡SD大鼠,共35只,隨機分為假手術組( Sham, n = 10),HIBD+培基移植對照組 (HIBD, n=12) , H I BD+NSCs移植組 (NSCs,n = 13)。

參照Rice方法[3],7d齡SD新生鼠乙迷麻醉后分離出左頸總動脈并結扎,休息2 h后,將大鼠置于有機玻璃低氧艙內,氧濃度在8%(7%～9%) ,艙內溫度控制在(36±2)℃,濕度為70% ±5% ,缺氧時間持續(xù)

2 h。實驗結束后將大鼠放回鼠籠由母鼠行母乳喂養(yǎng)。

HIBD損傷后3d,低溫麻醉后,將動物固定于立體定位儀 ,以左側感覺運動皮層區(qū)(坐標AP:+ 0. 3mm,ML:-2mm, DV:-1.5mm)為移植點 ,使用微量進樣器緩慢注入 2μl NSCs細胞懸液或培養(yǎng)基。

42 d齡時測試。參照 Bona[ 4 ]方法,包括4個試驗。行為學測試均按盲法進行。

1 .握持牽引試驗:大鼠用前爪抓住離桌面45cm水平放置的直徑為0.6 cm的空心塑料管懸掛,記錄其懸掛的時間(最大值為60 s,超過60s按60s計)和右側(缺血對側)后肢能否放到管子上。

2 .足錯誤試驗:記錄大鼠在水平放置的網格上(50cm×40 cm,每格3cm×3cm) 2min內前、后肢或爪子掉下來的次數 ,為排除不同大鼠活動度的差別的影響,只將左右側錯誤次數的差值進行統(tǒng)計學分析。

3 .姿勢反射試驗:抓住大鼠的尾巴 ,使之懸掛于距離桌面 50 cm高處。正常鼠將兩個前肢都伸向桌面(0分,而有腦損傷的大鼠損傷大腦半球對側的肢體呈屈曲狀(1分) ,然后將大鼠放在桌上,在肩后的側面加壓直到前肢伸直 ,重復數次 ,如果朝右側 (損傷大腦半球的對側 )的抵抗力減弱為異常 (2分)。

4 .肢體放置試驗:記錄大鼠在 6種不同的感覺刺激下左右側前后爪的放置情況 ,記錄每只鼠兩側得分的差值。計分標準如下: 0分 ,爪子放置正確、 迅速; 1分 ,遲緩或不完全正確; 2分 ,未放置。

參照 Balduini[ 5 ]方法。

1 . T迷宮自發(fā)交替:自 28 d齡起檢測。檢測動物在 T迷宮內連續(xù)測試中進入不同臂的趨勢。每只動物連續(xù)測試 3 d,每日 1次 ,每次給兩次改變方向的機會,結果分別記錄為改變率 0% , 50% ,或 100% ,同時記錄進入左右臂的次數。

2 . T迷宮強迫改變:自32d齡起檢測。測試分為兩個階段,預測試和測試。預測試時,動物被迫只能進入開放的臂內,并將食物吃完 ,然后將之放入起始臂內,關15 s后撤去所有的閘門開始測試。如果動物進入預測試時未進入的臂內 ,記錄為正確;如果進入預測試時已進入的臂內 ,記錄為錯誤。每只動物每日測試5次 ,每次間隔 15min,連續(xù) 4 d,共 20次。

根據使用說明書進行 nestine、 BrdU和 NF2 200單染或雙染操作。

計量數據以x±s表示,數據均用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計。

原代培養(yǎng)細胞24 h內就可以形成由2～3個細胞組成的小細胞團,即原代克隆,7d時生長為數十個細胞到數百個細胞的克隆 ,懸浮生長 ,呈球形。傳代后出現與原代培養(yǎng)相同的大量次代克隆,5～7d可再次傳代。間接免疫熒光細胞化學染色發(fā)現,NSCs標記蛋白nestin在各級克隆中都有表達。

1 . T迷宮自發(fā)交替試驗:HIBD組的大鼠選擇左側(缺血側) >右側,差異有顯著性意義(P< 0.05)。21T迷宮強迫改變:隨天數的增加,Sham組與NSCs組的正確率日漸增加,而HIBD組的正確率上升不明顯 ,說明學習能力較差。NSCs組的正確率較HIBD組有明顯增高 ,差異有顯著性意義 ( P < 0 . 05)。3 .感覺運動功能測試: NSCs組的握持牽引時間較HIBD組延長( P<0.05)。足錯誤試驗中, NSCs組的足錯誤次數右2左差值較HIBD組減少(P<0.05)。在姿勢反射測試中,NSCs組的正常率較HIBD組明顯增加(P< 0.05)。在肢體放置試驗中,NSCs組右-左的得分較HIBD組明顯減少(P<0.05)。41NSCs移植后檢測: NSCs移植 1月后 ,均可見不同程度的 BrdU陽性細胞沿針道分布 ,大量分布于移植點周圍 ,向腦實質內擴散 ,隨與移植點距離的增大陽性細胞逐漸減少。B rdU和NF2 200的免疫熒光雙標顯示部分BrdU陽性細胞同時也表達神經元特異性抗原NF2 200,提示NSCs移植到大鼠腦內1月后可分化為神經元。

研究表明 ,移植 NSCs入發(fā)育的大鼠腦內 ,細胞廣泛遷移,其分化結果與移植的部位有關。說明在體外擴增后,由NSCs分化的神經元保持了對新生鼠腦結構識別與定位的反應能力[ 6 ]。但是移植NSCs到成年動物的腦內,僅在神經發(fā)生的部位,如海馬才能分化為神經元,而在非神經發(fā)生的部位如小腦、紋狀體和脊髓則主要分化為膠質細胞[7 ]。干細胞移植后的遷移能力和與宿主神經細胞整合能力也隨年齡增長而逐漸下降[ 8 ],而且新生大鼠免疫機能不完善 ,腦內移植后宿主的排異反應相對較小。由此可見成年期和新生期的宿主對移植的 NSCs的反應是不同的,干細胞移植治療新生兒腦損傷性疾病較成人更有前途。本實驗結果顯示,從大鼠14d胚胎前腦皮質組織中分離出來的NSCS在生長因子EGF和bFGF存在的條件下可長期維持未分化狀態(tài)并不斷增殖 ,在撤除生長因子后,可分化為神經元和膠質細胞,具備了NSCS的基本屬性。將NSCs移植到新生大鼠HIBD模型的感覺運動皮質區(qū),可有效的改善HIBD所致的感覺運動障礙,在握持牽引測試、姿勢反射、足錯誤試驗和肢體放置試驗中的成績較對照組明顯提高;同時還有效的改善空間認識和學習記憶缺陷 ,在 T迷宮強迫改變試驗中的正確率增加。移植后 4周 ,所有的移植治療大鼠在移植部位都可見到存活的細胞 ,沿移植點向遠處遷移。本研究將 NSCs移植到感覺運動皮質后,能有效地改善其感覺運動缺陷,其機制可能與神經重建有關,免疫熒光雙標也顯示部分 BrdU陽性細胞同時也表達神經元特異性抗原NF2200,提示NSCs移植后可分化為神經元 ,可能是其發(fā)揮治療作用的機理之一。結果提示, NSCs移植到新生大鼠 H I BD后的腦內 ,不僅能存活 ,還能很好的與宿主腦組織整合并遷移,并可改善其遠期的學習記憶、空間辨別能力和感覺運動功能。為 NSCs移植治療新生兒 H IE提供了實驗依據。