癲癇持續(xù)狀態(tài)和慢性癲癇對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶和情感行為的影響

摘　要　目的:探討急慢性癲癇發(fā)作對(duì)大鼠認(rèn)知功能的影響。方法: 戊四氮(PTZ)誘導(dǎo)大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)和慢性癲癇(CEP) ,用交替電刺激Y迷宮試驗(yàn)、Morris水迷宮試驗(yàn)、抬高迷試驗(yàn)和曠場(chǎng)試驗(yàn)檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶和情感行為變化。結(jié)果: SE大鼠致癇后近期水迷宮逃避潛期延長(zhǎng)( P<0.05) ,平臺(tái)象限搜尋時(shí)間百分比降低( P<0. 01) ,穿越平臺(tái)區(qū)域次數(shù)減少( P<0.05) :宮選擇錯(cuò)誤總數(shù)增多( P<0. 05) ;抬高迷宮開放臂中逃避時(shí)間延長(zhǎng)( P<0. 05) ,進(jìn)入次數(shù)增多( P<0.05) ;曠場(chǎng)活動(dòng)的格子數(shù)、站立次數(shù)及糞便顆粒數(shù)均減少( P<0. 05) 。遠(yuǎn)期均恢復(fù)正常。CEP大鼠致癇后近期水迷宮部分時(shí)段逃避潛伏期延長(zhǎng)(P<0.05) ,遠(yuǎn)期恢復(fù)正常,Y迷宮選擇錯(cuò)誤總數(shù)近期和遠(yuǎn)期均增多( P<0. 05) :抬高迷宮開放臂中逃避時(shí)間和進(jìn)入次數(shù)及曠場(chǎng)活動(dòng)格子數(shù)、站立次數(shù)和糞便顆粒數(shù)與對(duì)照組相比均無(wú)明顯差別( P>0.05) 。結(jié)論: 癲癇持續(xù)狀態(tài)可導(dǎo)致大鼠短期學(xué)習(xí)記憶功能受損和情感行為異常:慢性癲癇引起的學(xué)習(xí)記憶能力降低持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),對(duì)情感行為無(wú)明顯影響。交替電刺激Y迷宮在檢測(cè)癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶功能方面可能較Morris水迷宮更靈敏。

關(guān)鍵詞　癲癇　學(xué)習(xí)記憶　情感行為　Morris水迷宮　交替電刺激Y　迷宮

　臨床發(fā)現(xiàn)很多癲癇患者除癲癇發(fā)作癥狀外,常伴有注意力分散、學(xué)習(xí)記憶力減退等多種認(rèn)知功能受損的表現(xiàn),極大的影響了患者的生存質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)旨在探討戊四氮(pentylenetetrazole,PTZ)化學(xué)點(diǎn)燃癲癇大鼠在各種迷宮試驗(yàn)中的學(xué)習(xí)記憶功能和情感行為的變化,為研究癲癇對(duì)認(rèn)知功能的影響提供了行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的參考依據(jù)。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康成年雄性Sprague2Dawley(SD)大鼠78只,體重200±20g,由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào):SCXK(冀)2003- 1- 003) 。經(jīng)兩次交替電刺激Y迷宮試驗(yàn)篩選后獲得合格動(dòng)物75只,隨機(jī)分為癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus,SE)組、SE對(duì)照組(ControlⅠ) 、慢性癲癇(chronicepilepsy,CEP)組和CEP對(duì)照組(Control Ⅱ) 。造模過(guò)程中出現(xiàn)死亡或不符合模型要求者,予以剔除并隨機(jī)補(bǔ)充,保證每組動(dòng)物15只。

二、模型制備

1. SE模型的制備:給予大鼠40mg/ kg腹腔注射PTZ溶液,10分鐘后注射20mg/ kg,然后每10分鐘注射10mg/ kg,直至誘發(fā)癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作,驚厥行為表現(xiàn)采用Racine六級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

2. CEP模型的制備:按35mg/ kg腹腔注射PTZ溶液,每48小時(shí)一次,直到連續(xù)三次RacineⅣ～Ⅴ級(jí)癇性發(fā)作。對(duì)照組與相應(yīng)模型組同時(shí)腹腔注射同等容量的生理鹽水。

三、迷宮試驗(yàn)

造模后24小時(shí)和30天兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行。造模后24小時(shí)的Morris 水迷宮試驗(yàn)(Morris water mazetest ,MWMT)共5天,前4天半為定位航行試驗(yàn)(placenavigationtest ,PNT) ,記錄大鼠從入水到找到站臺(tái)的時(shí)間即“逃避潛伏期”;第5天下午為空間探索試驗(yàn)(spatiai probe test ,SPT) ,記錄大鼠120秒內(nèi)在站臺(tái)所在象限搜尋時(shí)間百分比及穿越站臺(tái)區(qū)域的次數(shù)。造模后30天的MWMT共3天,前2天半為PNT,第3天下午為SPT。交替電刺激Y迷宮試驗(yàn)(alternativc electro2stimulusY2mazetest , AESYT)中,每天進(jìn)行30次嘗試,以動(dòng)物選擇錯(cuò)誤總數(shù)(totalerror ,TE)作為評(píng)價(jià)大鼠學(xué)習(xí)能力的指標(biāo)。抬高迷宮試驗(yàn)(elevatedplus mazetest ,EPMT)中,觀察5min內(nèi)大鼠在開放臂中的逃避時(shí)間和進(jìn)入開放臂的次數(shù)。曠場(chǎng)試驗(yàn)(openfield test ,OFT) 中,將大鼠置于一60cm×60cm×60cm無(wú)頂木盒底部中央,其底部被等分為36個(gè)小方格,記錄5分鐘內(nèi)大鼠經(jīng)過(guò)的格子數(shù)、后肢性站立次數(shù)及排出糞便顆粒數(shù)。記分標(biāo)準(zhǔn):大鼠1/ 2以上身體進(jìn)入相鄰方格、后肢性站立和每粒糞便各記1分。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法　各組檢測(cè)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(…x±s)表示,所有數(shù)據(jù)均采用SAS6. 12統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行t 檢驗(yàn)。

結(jié)　　果

一、模型情況

SE組大鼠25只,發(fā)作達(dá)Racine標(biāo)準(zhǔn)Ⅳ～Ⅴ級(jí)、持續(xù)30～60分鐘為造模成功,10只因強(qiáng)直收縮死亡。CEP組大鼠20只,16～22次注射后有15只出現(xiàn)連續(xù)3次RacineⅣ～Ⅴ級(jí)發(fā)作,達(dá)到完全點(diǎn)燃,5只因強(qiáng)直收縮死亡。腦電圖檢查示,SE模型者呈尖2慢波、尖波和棘波發(fā)放;CEP模型者顯示在低幅的9211Hzα背景節(jié)律下,陣發(fā)出現(xiàn)高幅多棘波;對(duì)照組腦電活動(dòng)無(wú)癲癇放電。

二、迷宮試驗(yàn)

11Morris水迷宮試驗(yàn)PNT中,各組大鼠逃避潛伏期平均值的分布情況見圖(Fig. 1,2,3,4) 。SE組大鼠造模后24小時(shí)逃避潛伏期比Control Ⅰ明顯延長(zhǎng), 差異有顯著性(P<0. 05) ,造模后30天無(wú)明顯差異( P>0. 05) ;CEP組大鼠逃避潛伏期與Control Ⅱ相比在前3天有明顯差異(P<0. 05) ,而第4、5及造模后30天無(wú)明顯差異(P>0. 05) 。SPT中,與相應(yīng)對(duì)照組相比,SE組大鼠造模后第5天站臺(tái)區(qū)域搜尋時(shí)間百分比低( P<0. 01) ,穿過(guò)站臺(tái)區(qū)域的次數(shù)少( P<0. 05) (Table 1) ;造模后第32天及CEP組大鼠造模后第5、32天站臺(tái)區(qū)域搜尋時(shí)間百分比及穿越站臺(tái)區(qū)域的次數(shù)與對(duì)照組相比無(wú)明顯差別(P>0. 05) (Table1) 。

21交替電刺激Y迷宮試驗(yàn)

與各對(duì)照組相比,致癇前各模型組第1、2天的TE總數(shù)均無(wú)明顯差異( P>0. 05) ,且各組第2天的TE總數(shù)均小于第l 天,差異有顯著性( P<0. 05) (Ta2ble2) ;致癇后SE組第1、2天及CEP組第1、30、31天的TE總數(shù)明顯增加,差異有顯著性( P<0. 05) ,SE組第30、31天的TE總數(shù)無(wú)明顯差異( P>0. 05) (Ta2ble3) 。31抬高迷宮試驗(yàn)和曠場(chǎng)試驗(yàn)與相應(yīng)對(duì)照組相比,SE組大鼠致癇后24小時(shí)在抬高迷宮開放臂中逃避時(shí)間延長(zhǎng),進(jìn)入開放臂的次數(shù)增多(P<0. 05) ,曠場(chǎng)活動(dòng)的格子數(shù)、站立次數(shù)及糞便顆粒數(shù)減少( P<0. 05) ;致癇后30天及CEP組致癇后24小時(shí)和30天以上各值無(wú)明顯差異( P>0. 05) 。

討　　論

PTZ引起的癲癇發(fā)作類似于人類自發(fā)性癲癇,可引起與人類極為相似的行為及神經(jīng)病理改變

,且不具有神經(jīng)毒性,對(duì)大鼠的記憶無(wú)影響。目前,從整體水平研究動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的方法有多種,不同的迷宮可檢測(cè)不同的學(xué)習(xí)記憶模式。Morris 水迷宮是研究動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶的模型,空間學(xué)習(xí)記憶是對(duì)整個(gè)環(huán)境的記憶,依賴于對(duì)幾種事物位置的整合,這種記憶主要是參考記憶。Y迷宮則可用于辨別性學(xué)習(xí)、工作記憶及參考記憶的測(cè)試。本研究采用改良的交替

電刺激Y迷宮,通過(guò)空間辨別2足底電擊的逃避性條件反射,檢測(cè)大鼠的空間分辨學(xué)習(xí)及逃避性記憶,屬于聯(lián)合型學(xué)習(xí)記憶,與Morris 水迷宮相比,它檢測(cè)的記憶內(nèi)容更豐富,對(duì)不同的記憶模式敏感性更高。曠場(chǎng)試驗(yàn)和抬高迷宮試驗(yàn)是檢測(cè)動(dòng)物情感行為的方法。曠場(chǎng)試驗(yàn)主要反映大鼠的活動(dòng)水平、探索能力和焦慮狀況;抬高迷宮中的開場(chǎng)和增高的區(qū)域刺激了大鼠固

有的恐懼和焦慮,使初入陌生環(huán)境的動(dòng)物出現(xiàn)明顯的防護(hù)性情感反應(yīng),這些實(shí)驗(yàn)對(duì)于量化分析實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的警覺水平、恐懼、焦慮狀況及環(huán)境適應(yīng)能力等有重要意義。實(shí)驗(yàn)表明SE可以導(dǎo)致大鼠短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)活動(dòng)能力、警覺水平以及恐懼、焦慮等防護(hù)性情感反應(yīng)下降,同時(shí)伴有空間學(xué)習(xí)和記憶能力受損。SE是頻繁而持續(xù)地癇性發(fā)作,長(zhǎng)時(shí)間的癇性發(fā)作導(dǎo)致神經(jīng)元損害或功能異常,進(jìn)而引起認(rèn)知功能的改變。CEP也引起學(xué)習(xí)記憶功能改變,但對(duì)情感反應(yīng)及活動(dòng)能力無(wú)明顯影響。另外,對(duì)于SE組,Morris水迷宮和交替電刺激Y迷宮試驗(yàn)均檢測(cè)出大鼠致癇后近期學(xué)習(xí)記憶功能受損,而遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶功能與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異。對(duì)于CEP組,Morris 水迷宮試驗(yàn)僅僅檢測(cè)出大鼠近期空間學(xué)習(xí)記憶功能部分受損;而交替電刺激Y迷宮試驗(yàn)則檢測(cè)出大鼠致癇后近期和遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力均受損,這說(shuō)明了交替電刺激Y迷宮試驗(yàn)在檢測(cè)癲癇大鼠學(xué)習(xí)記憶功能方面較Morris水迷宮試驗(yàn)更敏感。癲癇持續(xù)狀態(tài)和慢性癲癇對(duì)大鼠的認(rèn)知功能均有一定的影響,但程度不同,且有一定的時(shí)限性,說(shuō)明癲癇發(fā)作對(duì)認(rèn)知功能的影響是可逆的。從實(shí)驗(yàn)角度驗(yàn)證了癲癇發(fā)作可以導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物情感反應(yīng)及學(xué)習(xí)記憶能力受損。