D-熒光素鉀鹽/鈉鹽體內(nèi)使用手冊(cè)--Goldbio

  熒光素是一種常用的熒光素酶表達(dá)的活體成像生物發(fā)光報(bào)告子。以ATP和Mg²⁺作為輔因子，有氧條件下熒火蟲熒光素酶與水溶性底物反應(yīng)發(fā)出一種特有的黃綠色發(fā)射光，在37℃活體內(nèi)轉(zhuǎn)換為紅光。該反應(yīng)通過(guò)消耗ATP來(lái)指示是否存在能量或生命的存在。

  D-熒光素在生物技術(shù)領(lǐng)域是一種常用的試劑，尤其在活體成像方面。熒光素酶被接種在研究動(dòng)物中比如大鼠，小鼠，用來(lái)標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，干細(xì)胞或傳染病。通過(guò)生物熒光成像這個(gè)模式系統(tǒng)中D-熒光素的注射可以用來(lái)實(shí)時(shí)，非侵入性監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)程或藥物效率。

 

4，5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt

KC₁₁H₇N₂O₃S₂

分子量：318.42 g/mol

4，5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid sodium salt

NaC₁₁H₇N₂O₃S₂.H₂O

分子量：320.32 g/mol

儲(chǔ)存：-20℃避光保存。

 

l  D-熒光素鹽

u  熒光素鉀鹽（啟維益成, G156410）

u  熒光素鈉鹽（啟維益成,G156411）

l  DPBS(Dulbecco’s phosphate-buffered saline), without Ca²⁺ 或 Mg²⁺

l  Syringe filter, 0.2um

 

1.       室溫下融解D-熒光素（鉀鹽或鈉鹽）溶于DPBS(不含鈣或鎂)配成終濃度為15mg/ml。

2.       用5-10ml滅菌水預(yù)濕0.22 um濾膜然后棄去滅菌水。

3.       通過(guò)準(zhǔn)備好的0.22 um注射器式濾膜滅菌熒光素溶液。

4.       按照不同的方法接種到實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中（通常熒光素通過(guò)腹腔注射或靜脈注射的方式接種到動(dòng)物體內(nèi)）。

比如：按10ul熒光素儲(chǔ)存液/g體重的比例來(lái)注射（正常情況下每20g小鼠注射200ul，標(biāo)準(zhǔn)150mg/kg注射）。

5.       成像之前等待10-20分鐘可達(dá)到最大熒光素酶信號(hào)穩(wěn)定期。

6.       完成每個(gè)動(dòng)物模型的熒光素酶動(dòng)力學(xué)研究，以確定其信號(hào)達(dá)峰時(shí)間和平臺(tái)期。

 

  每個(gè)動(dòng)物模型和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的組織生物分布的動(dòng)力學(xué)是不同的，動(dòng)物模型注射完熒光素后為了確定達(dá)峰信號(hào)時(shí)間，在實(shí)驗(yàn)之前建議先建立每個(gè)體系的動(dòng)力學(xué)曲線。

為您的動(dòng)物模型的熒光素酶活性建立動(dòng)力學(xué)曲線：

 

1.       通過(guò)以下推薦的每個(gè)所列方法（腹腔注射，靜脈注射或皮下注射）注射熒光素。注射之前如果需要給動(dòng)物鎮(zhèn)靜，注意這樣可能使動(dòng)力學(xué)曲線（熒光素酶達(dá)峰時(shí)間）稍稍延伸。根據(jù)給藥途徑不同熒光素的生物分布是不同的。

   a.       如果你要注射熒光素時(shí)動(dòng)物依舊是清醒的，等待三分鐘，然后根據(jù)您的方法選擇（氣體或注射麻醉）使其鎮(zhèn)靜。參看附錄關(guān)于大鼠和小鼠麻醉劑/鎮(zhèn)痛藥物和劑量的使用。

   b.       把已經(jīng)使用鎮(zhèn)靜劑的動(dòng)物放入成像室中，在注射熒光素后大約五分鐘能看到熒光成像。

   a.       立即對(duì)動(dòng)物進(jìn)行鎮(zhèn)靜（如果沒(méi)有鎮(zhèn)靜）根據(jù)您的方法來(lái)選擇（氣體或注射麻醉）使其鎮(zhèn)靜。參看附錄關(guān)于大鼠和小鼠麻醉劑/鎮(zhèn)痛藥物和劑量的使用。

   b.       把已經(jīng)使用鎮(zhèn)靜劑的動(dòng)物放入成像室中，在注射熒光素后兩分鐘內(nèi)能看到熒光成像。

4.       為建立熒光素酶表達(dá)的動(dòng)力學(xué)曲線，對(duì)于腹腔（IP）或皮下（SQ）注射方法每隔5-10分鐘拍攝一次成像時(shí)間可達(dá)40-60 分鐘（對(duì)于靜脈注射（IV）方法：每1-5分鐘拍攝一次可達(dá)20-30分鐘）。（大部分注射麻醉劑可持續(xù)20-30分鐘，對(duì)于完整動(dòng)力學(xué)曲線研究將需要額外的劑量�。�

5.       對(duì)于您的動(dòng)物模型從動(dòng)力學(xué)曲線中選擇最佳的成像時(shí)間點(diǎn)。大部分動(dòng)物模型對(duì)于腹腔注射或皮下注射熒光素注入動(dòng)物體內(nèi)后大約10-20分鐘達(dá)到信號(hào)峰值，對(duì)于靜脈注射熒光素沒(méi)注入后2-5分鐘達(dá)到峰值。

 

6.       腹腔注射（IP）

1.       首先確定針的入口點(diǎn)。

2.       在膝關(guān)節(jié)的上部橫跨腹部畫一條想像的線。

3.       針應(yīng)該沿著動(dòng)物右側(cè)這條線并貼近中間插入。（對(duì)于雌鼠，針的入口點(diǎn)位于最后一個(gè)乳頭稍靠中間的部位。）

4.       針從小鼠的右側(cè)插入避開盲腸，盲腸是腹部左側(cè)一個(gè)大的充滿液體的器官。小腸（位于右側(cè)）不大可能被針刺穿。

5.       針的插入從插入點(diǎn)離尾部或橫向太遠(yuǎn)如上顯示將是危險(xiǎn)的，可能會(huì)注射到后腿里，這樣將會(huì)造成肌肉組織受傷。

6.       為完成腹腔注射，必須很好地控制好小鼠以防在操作過(guò)程中移動(dòng)。一旦針插入到腹部避免器官受損傷。

7.       控制好小鼠并傾斜以便使其頭向下，腹部露出來(lái)。

8.       用70%乙醇對(duì)注射位點(diǎn)進(jìn)行徹底消毒。

9.       對(duì)于腹部注射我們建議用25-27 gauge直徑的針，以30度角度插入腹部。

10.   針應(yīng)插入大約半厘米（4-5mm）的深度。

11.   輕輕地吸出以確認(rèn)針沒(méi)有穿透血管，腸或膀胱。

   a.       褐綠色吸出物表示針插進(jìn)了小腸。

   b.       黃色吸出物暗示針插進(jìn)了膀胱。

12.   如果任何液體被吸出，表示您的溶液被污染了必須棄掉并用一個(gè)新的注射器和針頭重新操作。

13.   如果沒(méi)有液體被吸出，你可以開始注射。

14.   取出針頭并記錄下注射的時(shí)間，以確定信號(hào)達(dá)峰時(shí)間。

按照小鼠腹腔注射操作流程。對(duì)于大鼠我們建議用一個(gè)25 gauge 直徑的針頭注射。

l  確保針是傾斜的。

l  使動(dòng)物的頭傾斜向下為了使腸內(nèi)物向下移動(dòng)，以保持腹部四分區(qū)下部為空腔。

l  為了精確注射深度防止深層注射，我們建議放一根導(dǎo)管在針頭上留出4-5mm為合適的深度。

l  確保注射體積，我們建議小鼠不超過(guò)2ml，大鼠不超過(guò)5ml（請(qǐng)參看附錄關(guān)于不同動(dòng)物和位點(diǎn)的不同注射體積。）

l  給大鼠注射時(shí)，用布蓋在大鼠的頭部防止小鼠和研究人員緊張。

采用化學(xué)或物理方法控制小鼠（參看附錄關(guān)于大鼠和小鼠麻醉劑/鎮(zhèn)痛藥物和劑量的使用。）輕輕地旋轉(zhuǎn)小鼠尾部使血管可見，用70%乙醇消毒，以輕微傾斜角度用（27-30 gauge）直徑大小的針頭插入血管。不能吸出，而是慢慢地注射并觀察透明的內(nèi)腔。不正確的位點(diǎn)在尾部將形成一個(gè)小的凸起。如果出現(xiàn)這種情況，取出針頭在原來(lái)位點(diǎn)的附近重新操作。完成之后，取出針頭并壓住注射點(diǎn)。記錄注射時(shí)間以確定信號(hào)達(dá)峰時(shí)間。

   尾部血管注射之前，誘導(dǎo)外圍血管擴(kuò)張是有益的，這樣能使血管變得更明顯�？梢杂冒谉霟籼岣咝∈蟮捏w溫或把小鼠尾部浸泡在溫水中，或用血管舒張劑處理比如甲苯噻嗪或乙酰丙嗪。你也可以用光源照透尾部，這樣將使血管易見和進(jìn)入。

安全的水溫是110℉或43℃，這個(gè)溫度使小鼠感到稍溫暖。雖然通過(guò)給麻醉小鼠加熱是有益的，但應(yīng)注意引起灼傷或過(guò)度加熱。

尾部血管位于鼠尾部的兩側(cè)，表面上看就是皮膚下面。如果正確地把針頭插入，你或許在針頭接口處能看到或看不到血液閃過(guò)，你也能感覺(jué)到當(dāng)針頭通過(guò)皮下組織進(jìn)入血管內(nèi)腔時(shí)阻力很小，同時(shí)，通過(guò)注射，液體將輕易地流入血管，血管將變得透明的（由暗變亮）因?yàn)橐后w暫時(shí)代替了血液（像上面圖片看到的那樣）。

尾部注射操作跟小鼠一樣。

1.  

    

把動(dòng)物放到一個(gè)控制裝置中并用水浴對(duì)尾部進(jìn)行加熱，注意不能使動(dòng)物過(guò)熱。

2.    

  

緊緊拉直尾巴并旋轉(zhuǎn)使靜脈血管朝上。離手指1cm處插入針頭。

3.     

穿透皮膚表面后，重新調(diào)整注射器與尾巴平行，然后慢慢注射。

4.    

  

取出針頭前用大母指按住注射點(diǎn)防止出血。

1.       用鎮(zhèn)靜藥物（參看附錄關(guān)于大鼠和小鼠麻醉劑/鎮(zhèn)痛藥物和劑量的使用）控制大鼠。

2.       拉伸后腿并把毛刮掉使隱靜脈露出。

3.       對(duì)注射點(diǎn)進(jìn)行消毒像止血一樣的壓力壓住腿的上部。

4.       把針頭插入靜脈并抽吸。

5.       放開按壓地方并注射。

6.       完成之后取出針頭并采取適當(dāng)止血。

7.       記錄注射時(shí)間以確定信號(hào)達(dá)峰時(shí)間。

對(duì)于大鼠靜脈注射我們建議用22-25 gauge直徑大小的針頭。

l  注射液中確定沒(méi)有氣泡或泡沫，這將使小動(dòng)物致死。

l  牢固而溫柔地控制動(dòng)物。

l  勿吸入

l  注射要慢

l  對(duì)尾部進(jìn)行溫水浴，這樣使血管顯而易見。

l  溶液將很容易流進(jìn)血管，如果沒(méi)有流入，重新?lián)Q針頭重復(fù)操作一次。

l  注射之后，用大母指短暫按壓注射點(diǎn)來(lái)止血。

皮下注射一般用于注射鎮(zhèn)靜劑或用來(lái)麻醉恢復(fù)期與溶液水合作用。皮下注射途徑一般縮寫為SC或SQ。溶液的注射量應(yīng)被限制，不能使皮膚過(guò)度伸展（那將是不舒服的），也不能進(jìn)行不必要地過(guò)度水合。一般皮下注射體積是1ml或更少。

l  最常用注射部位是頸部和肩部區(qū)域的松弛皮膚。

   按常規(guī)方法控制小鼠，用指頭提起皮膚像一個(gè)帳篷一樣。用70%乙醇消毒注射點(diǎn)。建議用22 gauge 直徑大小的針做皮下注射。

1.       提起背部的皮膚形成一個(gè)“帳篷”。（如果小鼠是醒著的，把小鼠放到線狀蓋上這樣在注射過(guò)程中它能用它的前爪抓緊。）

2.       背部皮膚并撐起，用手控制住小鼠然后在露出區(qū)域注射。

3.       在皮膚撐起的根部插入針頭，小心針頭扎著指頭。您的指頭應(yīng)該在撐起皮膚的頂部，針頭插入點(diǎn)的上部是安全的。握住針頭平行插入動(dòng)物體內(nèi)避免穿透下層組織。

4.       抽吸確保針頭沒(méi)有進(jìn)入血管。如果位置正確應(yīng)該沒(méi)有吸出物。

5.       以適當(dāng)?shù)乃俣茸⑸渫暌后w。

6.       取出針頭并按壓皮膚來(lái)封住皮膚上的針孔防止液體流出。

7.       檢查動(dòng)物任何滲血現(xiàn)象。因?yàn)橐后w已經(jīng)積在皮下間隙，你能看到并感覺(jué)到液體的氣泡，叫皰。

8.       記錄注射時(shí)間以確定信號(hào)達(dá)峰時(shí)間。

按照小鼠皮下注射方法，但按住大鼠是在桌子上而不是線狀籠上。建議用23-25 gauge直徑大小的針，并注射不超過(guò)5ml的液體。

l  最常用的注射位點(diǎn)是頸部和肩部周圍的松弛皮膚。

l  確保注射時(shí)針的傾斜角度很重要。

l  給大鼠注射時(shí)，用布蓋在大鼠的頭部防止小鼠和研究人員緊張。

l  輕輕地按注射點(diǎn)幫助驅(qū)散氣泡。

 

表1：推薦小鼠具體注射位點(diǎn)，注射體積和針頭大小

 

表2：不同給藥途徑和動(dòng)物模型建議注射位點(diǎn)，針頭直徑大小和注射體積（出處：Harkness and Wagner’s “Biology and Medicine of Rabbits & Rodents.”）

 

表3：大鼠和小鼠使用不同的鎮(zhèn)靜劑藥物

（IP=intraperitoneal; SC=subcutaneous; PO=per os(by mouth); IV=intravenous）

 

所有的注射方法來(lái)源于AALAS Learning Library

1.       Gustafson J, et al. (2009). Journal of Controlled Release, 140(3), 256-261.

2.       R.A. Bollinger. Dissertation: Evaluation of the Light Emission Kinetics in Luciferin/Luciferase-Based In Vivo Bioluminescence Imaging for Guidance in the Development of Small Animal Imaging Study Design.

3.       Boston University, Animal Care Research Compliance.

4.       Boston University, Animal Care Research Compliance.

5.       LSSU-School of Biological Science-Institutional Animal Care and Use Committee.

6.       Boston University, Animal Care Research Compliance.

7.       LSSU-School of Biological Science-Institutional Animal Care and Use Committee.

1.       US National Institute of Health

2.       Adapted from Harkness and Wagner’s “Biology and Medicine of Rabbits & Rodents.”

3.       Saskatchewan Association of Veterinary Technologists(SAVT).