One Step RT- PCR PreMix（染料法）使用說(shuō)明書(shū)

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One Step RT- PCR PreMix（染料法）
使 用 說(shuō) 明 書(shū)
 
【前言】
本產(chǎn)品提供了一個(gè)靈敏、高效、快速地?cái)U(kuò)增并檢測(cè) RNA 的完整系統(tǒng)。One Step RT- PCR preMix 包
含所有 RT-PCR 所需的、并經(jīng)優(yōu)化的 Reaction Buffer、RT 酶混合物等，使用者只需加入適量的引物和待檢
樣品，即可進(jìn)行 One Step RT- PCR 檢測(cè)。
本產(chǎn)品使用高效率 M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶和化學(xué)修飾的熱啟動(dòng) Taq  DNA  聚合酶，高保真的染料，為
RT-PCR 反應(yīng)提供了更高的產(chǎn)量及靈敏度、特異性。
【規(guī)格】
50 Reactions/Kit
【試劑盒組成】
A2010A0116s                  50test
Master Mix      750μl      1 支
Enzyme Mix    500μl      1 支
A2010A0116L                  100test
Master Mix      750μl      1 支*2
Enzyme Mix    500μl      1 支*2
【用戶自備的試劑、器材】
  1．引物
試驗(yàn)前應(yīng)準(zhǔn)備好用于檢測(cè)目的基因的引物。引物應(yīng)用HPLC或PAGE純化。
2．實(shí)驗(yàn)用水
使用DEPC處理的PCR用純水。
3．待檢樣品
總RNA，mRNA
4. RNasefree & DNasefree  的tip頭，離心管,薄壁PCR管等
5. 各種規(guī)格的移液器
6．Realtime PCR儀
本產(chǎn)品適用于下列Realtime PCR儀：ABI PRISM ® 7700、ABI PRISM ® 7500、ABI PRISM ® 7300、ABI
PRISM ® 7000、MJ Opticon  、BIORAD iCycler  、Roch   LightCycler TM  等Real time PCR儀上使用，具體
使用方法請(qǐng)參照相應(yīng)儀器的說(shuō)明書(shū)。
【反應(yīng)液配制】
反應(yīng)液組份  加量 (μl)  終濃度  備注
One Step RT - PCR Reaction Buffer  15    
Enzyme Mix  10    
上游引物  5  300nM  用戶自備
下游引物  5  300nM  用戶自備
待檢樣品  5-10  10pg~100ng  用戶自備
DEPC H 2 O  5-0    用戶自備
總體積  50    
注：1 通常初次使用本試劑時(shí)，可用引物濃度 300nM 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具體情況，在 200～1000nM 范圍內(nèi)調(diào)整引
物濃度。
2 引物、待檢樣品的具體加量用戶可以根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整，同時(shí)增減 DEPC 水用量，保證總反應(yīng)體積不變即可。
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【RT-PCR 擴(kuò)增檢測(cè)】
1 將反應(yīng)管放入熒光 PCR 擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。
2 循環(huán)參數(shù)設(shè)定（請(qǐng)參照各類儀器的操作說(shuō)明進(jìn)行設(shè)置）
步驟  溫度（℃） 時(shí)間  循環(huán)數(shù)（次）
1  逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)  50  15-30 分鐘 1
2  預(yù)變性  95  5 分鐘  1
3  變性  95  10 秒
4  退火、延伸及檢測(cè)熒光 60  45-60 秒
 
40-50
步驟 4 中 60℃時(shí)熒光檢測(cè)，檢測(cè)通道：FAM/HEX/VIC/ROX/CY5
 
注：以上擴(kuò)增條件為實(shí)例，用戶應(yīng)根據(jù)引物的 Tm 值及擴(kuò)增片段的大小來(lái)確定適合的變性時(shí)間、退火溫度，退火時(shí)間和
循環(huán)次數(shù)，黑體字部分必須保留。
【保存條件】
本產(chǎn)品原則上在-20℃以下冷凍保存，避免反復(fù)凍融。如果在短期內(nèi)需持續(xù)使用時(shí)，融解后可在4℃
保存，最長(zhǎng)可保存1周。
【注意事項(xiàng)】
1.本產(chǎn)品為研究用試劑。請(qǐng)勿作為診斷、臨床試劑用。
2.為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，請(qǐng)?zhí)貏e注意以下事項(xiàng)：
2.1 使用已校準(zhǔn)的移液器，選用進(jìn)口一次性使用的 PCR 反應(yīng)管、離心管、tip 頭等進(jìn)行樣本處理及配液等操作，所有用具
應(yīng)不含 DNA 酶和 RNA 酶。
2.2 引物設(shè)計(jì)過(guò)程中應(yīng)盡可能避免發(fā)夾結(jié)構(gòu)、二聚體等現(xiàn)象的發(fā)生， PCR目標(biāo)片段最好小于200bp，盡可能在150bp以內(nèi)。
2.3 實(shí)驗(yàn)樣品盡可能新鮮，提取過(guò)程應(yīng)嚴(yán)防 RNA 酶污染及操作不當(dāng)導(dǎo)致的 RNA 降解。
2.4 使用本產(chǎn)品時(shí)建議對(duì) RT-PCR 擴(kuò)增條件、引物濃度和樣品用量進(jìn)行調(diào)整，選擇最適當(dāng)?shù)囊�物濃度、樣品濃度�?PCR 擴(kuò)
增條件。
3.本產(chǎn)品使用前應(yīng)在室溫充分融解，并用漩渦震蕩器充分混勻。
4.統(tǒng)一配液后分裝以減少加樣誤差，每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照。
5.禁止標(biāo)記 PCR 反應(yīng)管，避免外源性熒光信號(hào)干擾。
6.PCR 反應(yīng)管中不能有氣泡，否則會(huì)產(chǎn)生非特異的熒光信號(hào)。若有氣泡，可先用手指將氣泡彈破，然后再低速離心消除。
7.實(shí)時(shí)熒光 PCR 儀器連續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，最好間隔一小時(shí)以上再使用。
8.實(shí)時(shí)熒光 PCR 儀需經(jīng)常校正和清潔載樣板板孔。
9.若使用Roch  LightCyclerTM  熒光PCR儀，應(yīng)將毛細(xì)管放在專門(mén)套管中，以便分裝反應(yīng)體系和加入待檢樣品。前述操作
完畢應(yīng)低速離心數(shù)秒再將毛細(xì)管垂直緩慢放入樣品架，以免折斷；若發(fā)生折斷，應(yīng)小心取出，用專用小毛刷擦拭干凈后
方可進(jìn)行擴(kuò)增。
10.實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格分區(qū)，避免 PCR 產(chǎn)物污染。
 
品質(zhì)保證：
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