實(shí)驗(yàn)常見問題解答匯集(一)

                                                       實(shí)驗(yàn)常見問題解答匯集(一)

BSP甲基化擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物可否直接測序，為什么需要構(gòu)建TA克隆后測序？

由于基因組DNA的每個(gè)CG位點(diǎn)甲基化程度各不相同，未發(fā)生甲基化的C會被重亞硫酸鹽修飾成為U，而C若發(fā)生甲基化則不變，這樣如果進(jìn)行PCR產(chǎn)物測序就有可能在原有的C位點(diǎn)得到雙峰圖，無法確定甲基化的程度，必需通過回收PCR產(chǎn)物，進(jìn)行TA克隆，隨機(jī)挑選5-10個(gè)單克隆測序的方式才能計(jì)算獲得每個(gè)CG位點(diǎn)的甲基化情況。

如何提高哺乳動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率？

對于生物技術(shù)科研實(shí)驗(yàn)，擬將外源基因（或DNA序列）導(dǎo)入到體外培養(yǎng)的細(xì)胞中（尤其是各類哺乳動物細(xì)胞），讓外源基因在細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)甚至翻譯，到達(dá)預(yù)期目的，那么除了保障攜帶基因的質(zhì)粒載體上具備高表達(dá)元件（啟動子、增強(qiáng)子、終止子等）之外，另外一個(gè)重要因素是讓外源基因的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到極高值，尤其對于基因干擾研究實(shí)驗(yàn)而言，達(dá)到80%以上的轉(zhuǎn)染效率，是干擾評價(jià)實(shí)驗(yàn)順利完成的前提保證。

關(guān)于如何提高轉(zhuǎn)染效率，以下是銳賽團(tuán)隊(duì)實(shí)踐一些心得，系統(tǒng)整理如下

1、細(xì)胞本身的狀態(tài)的重要性占著70%以上的比重。那么細(xì)胞生長狀態(tài)體現(xiàn)哪些方面
1）細(xì)胞周期：分裂期細(xì)胞往往要比靜止細(xì)胞更易于攝取并表達(dá)外源DNA。因此，細(xì)胞都在轉(zhuǎn)染當(dāng)天或前一天鋪板。同樣重要的是細(xì)胞在種板進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)不應(yīng)處于過度生長的狀態(tài)；此外對于原代細(xì)胞，還常用促有絲分裂刺激物（如病毒轉(zhuǎn)化，生長因子，條件培養(yǎng)基等）來活化。所以要觀察293系列細(xì)胞在鋪板后多長時(shí)間（12h?18h?24h?）到達(dá)分裂期，但又不能是過度生長狀態(tài)！
2） 細(xì)胞融合率（密度數(shù)量）：只要培養(yǎng)基質(zhì)（培養(yǎng)皿）尚有空間，細(xì)胞就會按指數(shù)規(guī)律分裂。對于正常細(xì)胞而言，細(xì)胞生長的速度受細(xì)胞密度大小的接觸抑制（癌細(xì)胞則不受此限制而會繼續(xù)生長并可互相疊加）。營養(yǎng)的耗竭以及代謝廢物的積聚會影響所有的細(xì)胞生長，細(xì)胞會因?yàn)槿狈�營養(yǎng)而不適于轉(zhuǎn)染。個(gè)人認(rèn)為一般293系列細(xì)胞鋪板50%密度，16-20h達(dá)70%可以轉(zhuǎn)染，切忌貼壁就轉(zhuǎn)染！
3） 傳代次數(shù)：傳代次數(shù)是指對一個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行分批傳代的頻度（通常在一個(gè)實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)）。某些細(xì)胞系相比較其他細(xì)胞系而言較不穩(wěn)定，可能會隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而改變，視不同的細(xì)胞系和培養(yǎng)條件而定，因此名稱相同的同一細(xì)胞系在生理學(xué)和形態(tài)學(xué)（以及轉(zhuǎn)染能力）性質(zhì)也可能會有很大差異；另外分板傳代培養(yǎng)時(shí)把貼壁細(xì)胞用胰蛋白酶消化，這個(gè)常規(guī)操作可導(dǎo)致正常細(xì)胞功能受到嚴(yán)重?fù)p害，因此要重視轉(zhuǎn)染前細(xì)胞的鋪板操作優(yōu)化（如胰蛋白酶消化時(shí)間的長短、胰蛋白酶的滅活等）。教科書上說，細(xì)胞在凍存復(fù)蘇后的一兩代之內(nèi)或直到它們完全復(fù)蘇之前都很難轉(zhuǎn)染。
4） 貼壁與懸�。涸谵D(zhuǎn)染效率方面貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞之間的差異顯著。相對于貼壁細(xì)胞（如HEK，CHO），懸浮細(xì)胞（如HL 60，Jurkat）非常難以轉(zhuǎn)染，可能是因?yàn)榧?xì)胞間膜結(jié)構(gòu)的差異，但目前還沒有分子水平上合理機(jī)制的解釋。
2、質(zhì)粒載體DNA的質(zhì)量也是轉(zhuǎn)染好壞的重要因素
1)一般原則：對純化所得的載體進(jìn)行質(zhì)量鑒定，在轉(zhuǎn)讓時(shí)一定要選用一種已知具有功能的載體做對照。
2)載體的完整性：書面報(bào)告中核實(shí)載體元件（啟動子/增強(qiáng)子/ORI等等）。
3) 載體的制備質(zhì)量：純化質(zhì)量情況，是否有其他載體交叉污染，制備產(chǎn)物中殘余的污染物（如氯仿、酒精、CsCl、內(nèi)毒素）可能會影響轉(zhuǎn)染效率。
3、培養(yǎng)條件影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的成敗
1） DNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物：轉(zhuǎn)染操作中復(fù)合物稀釋液的PH值變化很重要（個(gè)人經(jīng)驗(yàn)：某次轉(zhuǎn)染一批細(xì)胞中，有一孔的稀釋液與其他的不是同一管，結(jié)果感覺此孔的熒光比其他較強(qiáng)。 但是要得出結(jié)論需要反復(fù)驗(yàn)證，排除細(xì)胞狀態(tài)差異，隨機(jī)差異）。注意觀察培養(yǎng)基顏色。
2） 培養(yǎng)基的“新鮮”：保證培養(yǎng)基的新鮮，忌諱轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)時(shí)更換培養(yǎng)基體系，盡量減少試劑或添加劑的變更。
3 )營養(yǎng)的保證：血清、二氧化碳濃度稍微變化，會對結(jié)果有很大影響。
4 )杜絕有任何可能性污染時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：化學(xué)物質(zhì)、細(xì)菌、真菌的污染，還有細(xì)胞與細(xì)胞的交叉污染。

用同樣一個(gè)病毒載體系統(tǒng)進(jìn)行病毒包裝實(shí)驗(yàn)，為什么有人做的很好，次次成功，有人卻是時(shí)常做不出來,穩(wěn)定性很差，不是滴度低就是根本不出毒?

從我們對不同載體系統(tǒng)病毒包裝的多年經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，主要以下幾個(gè)方面心得

第一，病毒包裝的幾個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)就是細(xì)胞因素、載體系統(tǒng)（盡量使用成熟的商業(yè)化載體系統(tǒng)）、構(gòu)建重組的質(zhì)粒正確與否、質(zhì)粒抽提純化情況、包裝轉(zhuǎn)染控制（24、48小時(shí)的細(xì)胞及熒光狀態(tài)判斷）、目的基因?qū)Σ《景�裝影響（基因大小、序列情況、蛋白功能毒性等都會影響到是否能包裝成功）。
第二，如果有細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的常規(guī)經(jīng)驗(yàn)，細(xì)胞因素應(yīng)該沒有什么問題（細(xì)胞培養(yǎng)人員一定要關(guān)注，包裝或轉(zhuǎn)染感染前一定要重視細(xì)胞干凈細(xì)微污染與否、飽滿立體感是否好、鋪板均勻細(xì)胞密度適中否），細(xì)胞產(chǎn)毒出毒期間過程中的活力是包裝正常和出來的病毒滴度高低的一個(gè)重要環(huán)節(jié)（正常包裝出病毒情況，慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝一個(gè)細(xì)胞出一個(gè)病毒顆粒，腺病毒是1000個(gè)，腺相關(guān)病毒是10000個(gè)），所以實(shí)踐操作表明，病毒包裝轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的密度要控制，使得收毒（72小時(shí)）時(shí)細(xì)胞密度在90%-95%左右。
第三，建議使用商品化的成熟毒載體系統(tǒng)（不要用來路不清或基本被淘汰很少人在使用的系統(tǒng)），從文獻(xiàn)和我們多年的實(shí)踐可以結(jié)論，這類系統(tǒng)是穩(wěn)定的，因而分析原因時(shí)盡量少花精力在對載體系統(tǒng)的驗(yàn)證上，這樣會白花力氣。
第四，至于包裝轉(zhuǎn)染時(shí)的操作控制細(xì)節(jié)及其轉(zhuǎn)染試劑因素，只要在操作時(shí)按相關(guān)使用說明和操作步驟，應(yīng)該沒有大問題，所以也不要白花太多精力在這上面。
第五，另一個(gè)需要重點(diǎn)關(guān)注和排查的因素就是目的基因的表達(dá)載體構(gòu)建和抽提純化環(huán)節(jié)，是否構(gòu)建時(shí)導(dǎo)致質(zhì)粒載體重組或某個(gè)部件缺失，或污染別的質(zhì)粒或雜物？中抽純化是否污染？是否抽提的是別的質(zhì)粒？要養(yǎng)成同時(shí)做陰性對照的習(xí)慣（是否目的基因載體和陰性對照GFP載體是同一批，建議同一批，建議每次包裝都如此操作），如果這個(gè)環(huán)節(jié)沒有啥問題，在構(gòu)建中出現(xiàn)重組和缺失、或抽提純化失敗的可能性也不大。
第六，落實(shí)了上面那些因素，那就是最后一個(gè)原因，目的基因的大小、序列情況、該目的蛋白的功能毒性等導(dǎo)致無法包裝成功（實(shí)踐中，這種情況是有的，我們偶爾會遇到，可能原因是一些基因表達(dá)翻譯后對包裝細(xì)胞產(chǎn)生毒性，導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)異常），那么我們能做的就是換病毒包裝載體系統(tǒng)，嘗試其他載體系統(tǒng)能否包裝出來。不過這種情況出現(xiàn)的幾率非常低，你做上100個(gè)基因，也可能碰不上一個(gè)。
因而總的來說，我們進(jìn)行病毒包裝實(shí)驗(yàn)時(shí)要重視包裝材料——細(xì)胞及表達(dá)質(zhì)粒（對拿過來的細(xì)胞和載體系統(tǒng)要驗(yàn)證，常出現(xiàn)包裝細(xì)胞、空表達(dá)載體質(zhì)粒就有問題，我們要定期純化生產(chǎn)包裝細(xì)胞、空表達(dá)載體質(zhì)粒），細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)讓它“白白胖胖、活力充沛”，目的基因的表達(dá)載體構(gòu)建純化良好，質(zhì)粒間比例得當(dāng)，病毒包裝實(shí)驗(yàn)還是能有較好的結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)常見問題解答匯集.pdf

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