伯豪客戶通過串聯(lián)刪除吸水鏈霉菌5008的γ丁內脂受體基因提高井岡霉素產量
γ丁內脂（γ-butyrolactone簡稱GBL）生物合成基因afsA和GBL受體基因arpA的兩對同系物位于吸水鏈霉菌基因組的不同位置。井岡霉素是一種重要的抗菌抗生素，同時也是抗糖尿病藥物合成的關鍵底物。抑制afsA能夠使急劇降低井岡霉素的生物合成，刪除arp同系物能夠分別增加井岡霉素的產率26%（ΔshbR1）和20%（ΔshbR3）。shbR1/R3同時突變導致adpA-H(S. hygroscopicus ortholog of the global regulatory gene adpA)以及井岡霉素的轉錄水平升高，井岡霉素產量能提高55%。通過串聯(lián)刪除GBL受體基因設計高產量工業(yè)菌株，井岡霉素的產量從19g/L增加到24g/L （%26），產率從6.7gL-1 d-1增加到9.7 gL-1 d-1（45%），這是以前從未報道過的。該研究文章發(fā)表在《METABOLIC ENGINEERING》雜志，影響因子6.767。
該研究中RNA測序Analyzer IIx (Illumina)技術測序服務由上海伯豪生物提供完成。
研究背景
鏈霉菌屬是抗生素以及農業(yè)、醫(yī)療應用中有生物活性的次級代謝物獲取的豐富資源。通過調控放線菌屬所在的環(huán)境以及生理條件能夠減少轉錄抑制、增加轉錄活性從而提高目的次級代謝物的產量。GBL調控系統(tǒng)在放線菌次級代謝調控中非常重要，至少60%放線菌都會產生GBLs。其中A-factor作為一種GBL其調控機制已經為廣泛研究。三個關鍵蛋白AfsA，ArpA和AdpA構成了A-factor級聯(lián)調控系統(tǒng)。當A-factor達到一定水平會綁定到受體蛋白ArpA上，進而啟動抗生素合成。井岡霉素是由吸水鏈霉菌5008產生的一種重要的農用抗生素，而且是抗糖尿病藥物底物α-葡萄糖苷酶抑制劑（voglibos）重要合成來源。因此理解井岡霉素生物合成和發(fā)酵調控被廣泛研究。但是設計調控井岡霉素生物合成的研究卻比較缺乏。之前已有研究報道了吸水鏈霉菌5008的基因組，以及基因組上的三對同系物afsA-arpA以及adpA。也有研究闡明了adpA同系物的作用。但是afsA和arpA同系物的調控作用以及afsA在次級代謝中的作用還并不知道。
研究結果
1. 鏈霉菌屬中多對同系物afsA及arpA共存
通過對19種鏈霉菌全基因組序列比對研究，發(fā)現(xiàn)有7中鏈霉菌都有多對afsA-arpA同系物存在（Fig 1）。說明在多種鏈霉菌中存在多個afsA-arpA同系物共存是普遍現(xiàn)象。在吸水鏈霉菌5008基因組上有三對afsA-arpA同系物，作者對發(fā)酵過程中的多個時間點監(jiān)測了shbAs和shbRs的轉錄水平，發(fā)現(xiàn)相鄰的shbAs和shbRs同系物對有相似的轉錄模式，然而在不同的shbAs-shbRs對之間轉錄模式卻是不同的（Fig 2A）。AdpA在A-factor集成調控中起著中心作用，通過對adpA同系物研究，發(fā)現(xiàn)在12到84小時中其轉錄水平并無顯著差異（Fig 2B）。
2. afsA及arpA同系物參與井岡霉素生物合成
分別刪除afsA以及arpA同系物。shbA1失活導致井岡霉素產量下降超過90%；ShbA2和shbA3失活分別導致產量下降77%和61%（Fig 3A）。ΔshbR1和ΔshbR3能夠顯著增加井岡霉素的產量分別為26%和20%。ShbR2刪除井岡霉素產量無顯著改變。以上結果說明刪除arpA（shbR1和shbR3）同系物能夠提高井岡霉素生物合成，而刪除afsA同系物能抑制其合成。
3. ShbR1通過雙向調控機制抑制adpA-H轉錄
接下來作者研究了ShbR1對adpA-H轉錄的調控作用。ShbR1突變24h時adpA-H轉錄水平顯著上調（Fig 4A）。EMSA實驗表明ShbR1能夠綁定adpA-H啟動子區(qū)域（Fig 4B）。以上結果表明ShbR1能夠通過直接綁定adpA-H啟動子來抑制其轉錄。刪除shbR1 48小時前，shbR3轉錄水平顯著下調（Fig 4C）。EMSA實驗還顯示shbR1也能夠結合到shbR3和shbA3的基因間區(qū)（Fig 4D）。shbR1可能能夠通過結合到shbR3啟動子正向調控shbR3。ShbR1能夠通過直接作用和間接作用抑制adpA轉錄。
4. 共同失活shbR1/R3能增加井岡霉素產量
通過對野生型以及shbR突變菌株發(fā)酵隨時間變化進行觀測，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后期，井岡霉素產量和產率在shbR1/shbR3共同突變時相對野生型增加55%和95%（Fig 5A）。井岡霉素終產量也在shbR1/shbR3共同突變比分別突變shbR1和shbR3顯著提高。shbR1突變和shbR1/R3共同突變時，相比野生型，細胞增長在發(fā)酵48小時后下降（Fig 5B）。同時shbR1/R3共同突變時，adpA-H和valABC轉錄水平比野生型或者shbR1單獨突變時高（Fig 5CD）。
以上結果表明同時刪除shbR1/shbR3能夠完全抑制adpA-H轉錄，增加井岡霉素產量。
5. 同時突變后轉錄分析
為了研究shbR1/shbR3缺失對細胞代謝的影響，本研究采用RNA測序對野生型以及shbR1/shbR3同時突變菌株進行轉錄的比較分析。shbR1/shbR3同時突變菌株有559個突變基因，其中158個基因上調，401基因下調。結果如預期的一樣，很多參與次級代謝的基因在都呈現(xiàn)上調趨勢，如井岡霉素基因簇SHJG0271–SHJG0285（Table 1）。功能富集分析結果說明shbR1/shbR3失活能影響整個細胞代謝，包括次級代謝物合成，中心碳代謝，細胞外水化酶分泌以及轉運系統(tǒng)。
6. 通過串聯(lián)刪除GBL受體基因設計高產菌株提高井岡霉素產量
同時刪除高產量工程菌S. hygroscopicus TL01的shbR1和shbR3基因，結果如Fig 6A，TL01細胞生長并無統(tǒng)計學顯著性。在double-mutated TL01 (TL-DM)中,井岡霉素產量增加了26%，達到24 g/L (Fig. 6B)。此外，工程菌株產率在48h發(fā)酵產率從6.7gL-1 d-1增加到9.7 gL-1 d-1，比之前報道的7gL-1 d-1顯著提高。此外，井岡霉亞基胺（井岡霉素的中間產物）的產量也顯著增加51%（Fig 6C）。
研究結論
該研究闡述了多對afsA-arpA同系物參與調控井岡霉素生物合成，ShbR3能夠直接抑制adpA-H轉錄，ShbR1能夠抑制直接綁定adpA-H啟動子區(qū)域直接抑制adpA-H轉錄，也可通過正調控shbR3間接抑制adpA-H轉錄。同時失活ShbR1和ShbR3解除adpA-H阻遏，進而增加井岡霉素產量。該研究對于設計個體高產菌株提高井岡霉素產量以及理解多afsA-arpA同系物共存在調控機制有重要意義。
原文出處
Gao-Yi Tan, Yao Peng, Chenyang Lu, Linquan Bai, Jian-JiangZhong. Engineering validamycin production by tandem deletion of r-butyrolactone receptor genes in Streptomyces hygroscopicus 5008. Metabolic Engineering Volume 28, March 2015, Pages 74–81.
