藥物疾病治療的研究思路：由表及里，由淺到深

 一種藥物運(yùn)用于疾病治療需要前期的研究工作，怎么去研究某一種藥物對(duì)一個(gè)疾病的作用機(jī)制呢？這邊通過(guò)一篇發(fā)表在《Experimental Cell Research》上關(guān)于槲皮素用于治療肺動(dòng)脈高血壓的報(bào)道來(lái)了解下藥物疾病治療的研究思路。

研究背景

肺動(dòng)脈高壓（PAH）是一種多因素引起的復(fù)雜疾病，有關(guān)PAH發(fā)生特異性信號(hào)通路靶向藥物的開(kāi)發(fā)是大家所關(guān)心的熱點(diǎn)。

槲皮素是一種存在很多蔬菜水果中的常見(jiàn)類(lèi)黃酮。近年來(lái)的研究表明槲皮素可通過(guò)抑制增殖，誘導(dǎo)凋亡，細(xì)胞周期阻滯和減少轉(zhuǎn)移而用于抗氧化，炎癥和癌癥治療。此外，也有研究報(bào)道槲皮素可以抑制冠狀和肺動(dòng)脈舒張和降低血壓，但是具體的分子機(jī)制還不清楚。

因此，本研究的目的就是通過(guò)在大鼠模型中缺氧誘導(dǎo)PAH來(lái)探究槲皮素的作用機(jī)制。

一槲皮素可以治療肺動(dòng)脈高壓么？ 
     
要想研究槲皮素對(duì)PAH的藥效，首先得確認(rèn)槲皮素是否對(duì)PAH有作用。研究人員利用大鼠缺氧條件下，每天給予100mg/kg槲皮素4周。結(jié)果顯示，缺氧組比正常組表現(xiàn)出高的RVSP和右心室肥大。而用槲皮素治療組的RVSP增長(zhǎng)被明顯抑制了。同時(shí)，缺氧條件下的大鼠體重降低表型也在槲皮素治療后受到抑制，右心室肥大也在藥物治療組得到抑制。肺動(dòng)脈重建檢測(cè)顯示槲皮素治療組可顯著抑制由于缺氧引起的胞壁增厚和肺小動(dòng)脈肌化。因此，從這部分結(jié)果可以看到槲皮素可以有效改善缺氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓和肺動(dòng)脈重塑。

                                                                                                                                                                                         

二槲皮素治療是怎么樣起作用的？ 
     
在肺動(dòng)脈重塑過(guò)程中，肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）是重要的中介。那么，槲皮素是否是直接抑制了PASMCs的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡呢？肺切片PCNA，Ki67和TUNEL染色表明，槲皮素處理后細(xì)胞凋亡比例顯著增加，增殖明顯抑制。因此，槲皮素通過(guò)抑制了PASMC細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)其凋亡而逆轉(zhuǎn)缺氧誘導(dǎo)的凋亡耐受。

MTT檢測(cè)顯示，PASMCs抑制缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯計(jì)量效應(yīng)。細(xì)胞周期檢測(cè)表明，缺氧條件下的槲皮素處理后G1階段的PASMCs積累更多。因此，槲皮素可以引起細(xì)胞周期阻滯。Western blot檢測(cè)顯示缺氧誘導(dǎo)cyclin D1下調(diào)，cyclin B1和Cdc2上調(diào)，而當(dāng)槲皮素處理后，這些蛋白的表達(dá)變化有所緩解。所以，槲皮素可以緩解在缺氧條件下PASMCs的細(xì)胞周期過(guò)程的變化。

既然槲皮素可以抑制PASMCs增殖，增強(qiáng)其凋亡，那么，槲皮素的抗增值活性怎么樣呢？BrdU免疫檢測(cè)顯示，槲皮素可顯著減少由于缺氧引起的DNA合成增加。此外，AnnexinV-FITC分析表明隨著劑量的增加，細(xì)胞凋亡增強(qiáng)。Western blot檢測(cè)表明凋亡調(diào)控蛋白Bax和Bcl-2在槲皮素處理后顯著緩解由于缺氧引起的表達(dá)變化。因此，槲皮素可顯著增強(qiáng)

PASMCs細(xì)胞在缺氧條件下的抗增殖和凋亡過(guò)程。缺氧誘導(dǎo)的PAH最重要的發(fā)展過(guò)程之一是PASMC的遷移。通過(guò)Transwell系統(tǒng)分析顯示槲皮素可以有效抑制由于缺氧引起的PASMCs的遷移增加，且表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)。遷移相關(guān)蛋白檢測(cè)表明MMP-9，MMP2，CXCR4，integrin β1和integrin α5的表達(dá)減少可以被槲皮素緩解。因此，槲皮素在抑制缺氧下PASMC的遷移起著重要的調(diào)控作用。

三槲皮素治療PAH的生物學(xué)機(jī)制是什么？ 
     
上述的研究對(duì)于槲皮素治療PAH的機(jī)理可以說(shuō)已經(jīng)非常清楚了。在缺氧誘導(dǎo)的PAH中，槲皮素通過(guò)調(diào)控PASMC細(xì)胞的增殖，細(xì)胞周期，凋亡和遷移過(guò)程而起到治療效果。那么，內(nèi)在的生物學(xué)機(jī)制是什么呢？是哪些基因，或者通路調(diào)控而表現(xiàn)出這些現(xiàn)象？研究人員在上海伯豪運(yùn)用Agilent Whole Rat Genome array進(jìn)行了全基因組差異基因篩選。GO pathway分析顯示，缺氧組相比正常組的差異基因主要集中在細(xì)胞過(guò)程，結(jié)構(gòu)發(fā)育，生物過(guò)程調(diào)控，器官發(fā)育等過(guò)程。而在用槲皮素治療后，下調(diào)基因主要集中在生物過(guò)程反饋，細(xì)胞過(guò)程調(diào)控，脅迫反應(yīng)等過(guò)程。同時(shí)，對(duì)比正常組，缺氧組和缺氧藥物處理組的34個(gè)差異基因主要是一些與凋亡，增殖，細(xì)胞周期和遷移相關(guān)基因。芯片的結(jié)果也顯示TrkA通路的基因表達(dá)發(fā)生了顯著的變化，特別在槲皮素處理后發(fā)生了明顯的下調(diào)。因此，在槲皮素治療缺氧引起的PAH過(guò)程中，TrkA通路是其重要的調(diào)控通路。

為了進(jìn)一步研究槲皮素對(duì)TraK信號(hào)通路的調(diào)控能力，研究人員對(duì)TrkA及AKT的磷酸化水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，具有活性的p-TrkA水平在缺氧時(shí)顯著增加，p-AKTde顯著減少，而在槲皮素處理后這種變化會(huì)被顯著抑制。當(dāng)有TrkA激活子NGF處理時(shí)，可以部分抵消掉槲皮素處理引起的緩解作用。因此，槲皮素可能是通過(guò)抑制PASMCs細(xì)胞中的TrkA/AKT信號(hào)通路而影響缺氧造成的肺動(dòng)脈高壓。

點(diǎn)評(píng) 

該研究通過(guò)大鼠缺氧誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓模型，從槲皮素是否能治療肺動(dòng)脈高壓？怎么起作用的？?jī)?nèi)在的調(diào)控機(jī)制是什么？三個(gè)問(wèn)題出發(fā)，由表及里，由淺到深，為槲皮素可能用于肺動(dòng)脈的治療提供了寶貴的資料。

原文出處：

He Y, Cao X, Liu X , Li X, Xu, Liu J, Shi J. Quercetin reverses experimental pulmonary arterial hypertension by modulating the TrkA pathway. Exp Cell Res.2015