長(zhǎng)期社會(huì)隔離對(duì)雌性大鼠行為生理的影響

摘要:為研究社會(huì)隔離能否導(dǎo)致雌性嚙齒動(dòng)物產(chǎn)生焦慮，將成年雌性大鼠分別進(jìn)行單獨(dú)隔離飼養(yǎng)(單養(yǎng))和四只一籠群養(yǎng)，十周后進(jìn)行行為學(xué)和生理測(cè)試。行為結(jié)果顯示:與群養(yǎng)組相比，單養(yǎng)組大鼠在曠場(chǎng)中的直立次數(shù)減少，明暗箱測(cè)試中的暗箱停留時(shí)間增長(zhǎng)，穿越次數(shù)減少;說(shuō)明長(zhǎng)期社會(huì)隔離使雌鼠產(chǎn)生了焦慮。雖然兩組大鼠與應(yīng)激和生殖相關(guān)的生理器官重量沒(méi)有差異，但單養(yǎng)組血清皮質(zhì)醇和孕酮水平比群養(yǎng)組低，說(shuō)明長(zhǎng)期社會(huì)隔離導(dǎo)致雌鼠下丘腦唾體一腎上腺軸和下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)異常，可能會(huì)對(duì)雌鼠的生殖生理帶來(lái)不利影響。

關(guān)鍵詞:社群隔離;雌性大鼠;焦慮行為;血液激素;生理指標(biāo)

正常的社會(huì)關(guān)系對(duì)生物個(gè)體的健康有著重要意義，一旦遭到破壞將對(duì)機(jī)體帶來(lái)消極影響。長(zhǎng)期社會(huì)隔離對(duì)群居動(dòng)物來(lái)說(shuō)是一種生存應(yīng)激。這種應(yīng)激模型為研究人類(lèi)精神疾病提供了很好的切入點(diǎn)，被廣泛用于人類(lèi)精神障礙疾病的發(fā)病機(jī)制、新藥研發(fā)和預(yù)防等的研究。

社會(huì)隔離能使群居動(dòng)物腦的形態(tài)、激素水平以及神經(jīng)化學(xué)通路發(fā)生改變，進(jìn)而使該動(dòng)物表現(xiàn)出異常的行為和生理特征。以往研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期社會(huì)隔離會(huì)導(dǎo)致嚙齒動(dòng)物多動(dòng)，攻擊行為增加困，在新環(huán)境中缺乏正常的習(xí)慣化行為，前脈沖抑制(prepulse inhibition, PPI)缺失等。然而，社會(huì)隔離對(duì)嚙齒動(dòng)物的影響受到很多因素的制約，與被測(cè)動(dòng)物的性別年齡、品系以及隔離持續(xù)的時(shí)間均有關(guān)系。例如，社會(huì)隔離能使成年的雌性小鼠(M。musculus)'腎上腺肥大，動(dòng)情周期縮短，使成年雌性大倉(cāng)鼠(Tscheskia triton)的卵巢和子宮增大，但是對(duì)雄性大鼠(Rattus norvegicus )、雄性小鼠(Musmusculus)}和成熟的大倉(cāng)鼠則沒(méi)有影響;3周齡的雄性bong Evan大鼠隔離12周可以增加其對(duì)酒精的偏好，但是在成年期進(jìn)行隔離則不會(huì)出現(xiàn)此現(xiàn)象,最近的研究表明短期隔離或者每天隔離1h，持續(xù)四周會(huì)導(dǎo)致草原田鼠血清皮質(zhì)酮顯著升高;但是長(zhǎng)期隔離四周則對(duì)血清皮質(zhì)酮沒(méi)有影響

社會(huì)隔離能否使鼠類(lèi)產(chǎn)生脅迫和應(yīng)激反應(yīng)，與鼠類(lèi)在自然條件下的生活方式也有密切關(guān)系少〕。研究表明單養(yǎng)對(duì)大鼠、小鼠和長(zhǎng)爪沙鼠( Merionesunguiculatus)等群居動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生脅迫效應(yīng)，引起焦慮反應(yīng)而對(duì)營(yíng)獨(dú)居生活的金倉(cāng)鼠(Mesocricetus auratus)和大倉(cāng)鼠則是有利的關(guān)于社會(huì)隔離對(duì)大鼠應(yīng)激反應(yīng)的影響研究尚存在爭(zhēng)議，比如有些研究發(fā)現(xiàn)社會(huì)隔離引起大鼠血清中促腎上腺皮質(zhì)激素(Adreno-('.orticotropic Hormone,ACTH)和皮質(zhì)酮的升高ya.zz爪有些研究中則是降低，還有些研究發(fā)現(xiàn)ACTH和皮質(zhì)酮的水平在群養(yǎng)和隔離飼養(yǎng)動(dòng)物之間差異不顯著

在本研究中，我們將以成年雌性大鼠為研究對(duì)象，一定條件下，雌性的應(yīng)激反應(yīng)明顯高于雄性大鼠，但以往的社會(huì)隔離研究用雄鼠比較多，采用高架十字迷宮(elevated plus maze,  EPM)曠場(chǎng)(open field)和明暗箱(light/dark box) 3種經(jīng)典的焦慮測(cè)試方法來(lái)檢測(cè)長(zhǎng)期社會(huì)隔離(隔離l0周)能否引起雌性大鼠的焦慮反應(yīng);皮質(zhì)醇、孕酮、雌二醇等激素水平與群養(yǎng)組大鼠是否存在差別;應(yīng)激、生殖相關(guān)的腎上腺、脾臟、子宮、卵巢、包皮腺等器官重量是否發(fā)生了變化。本研究將有助于進(jìn)一步加深人類(lèi)對(duì)嚙齒類(lèi)動(dòng)物社會(huì)隔離焦慮模型的理解。

1材料與方法

1.1 動(dòng)物

24只2個(gè)月齡成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠，初始體重(196.3 ^-242. 6 g)，購(gòu)買(mǎi)于北京維通牙日華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司�？紤]到雌性SD大鼠是褐家鼠的變種，在野外屬于群養(yǎng)動(dòng)物，在實(shí)驗(yàn)前，4只雌鼠同籠飼養(yǎng)，買(mǎi)回后適應(yīng)1周;每天進(jìn)行陰道分泌物的涂片，觀察動(dòng)情周期的變化，選擇有正常動(dòng)情周期的大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。飼養(yǎng)大鼠的房間的光暗周期是14I, / lOD，光周期逆轉(zhuǎn)(早晨08:00關(guān)燈，22:00亮燈)，室溫控制在(22士2)0C。整個(gè)實(shí)

驗(yàn)期間，供給充足的食物和水，食物為標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料。實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們隨機(jī)將24只雌鼠分為兩組，其中12只四只同籠飼養(yǎng)，作為群養(yǎng)組，其他12只單籠飼養(yǎng)，作為社會(huì)隔離組。標(biāo)準(zhǔn)大鼠塑料飼養(yǎng)籠(37 cmX 26 cmX 17 cm)內(nèi)連續(xù)飼養(yǎng)10周。

為了排除動(dòng)情對(duì)行為和激素結(jié)果的影響，我們只選用非動(dòng)情期大鼠的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。為了避免人為因素對(duì)大鼠行為和激素水平的影響，我們?cè)诖笫蟮男袨闇y(cè)試和取血樣之后檢查其陰道分泌物涂片，確定其動(dòng)情狀態(tài)。動(dòng)情期大鼠陰道分泌物全部是無(wú)核角質(zhì)化細(xì)胞或間有少量上皮細(xì)胞。

1. 2行為測(cè)試

所有的行為測(cè)試都是在光線較暗的安靜的房間進(jìn)行。測(cè)試時(shí)間為9:30-16:30(大鼠光周期的暗相)。行為測(cè)試時(shí)，按照高架十字迷宮、曠場(chǎng)和明暗箱的順序依次測(cè)定，每只鼠每天只進(jìn)行一次測(cè)試。

1. 2. 1高架十字迷宮 高架十字迷宮由上海欣軟信息科技有限公司提供，包括兩個(gè)開(kāi)放臂(45 cm X 10 cm)、兩個(gè)封閉臂(45 cm X 10 cm X40 cm)以及10 cm X 10 cm的中心區(qū)域，封閉臂和開(kāi)放臂交叉呈十字形，整個(gè)迷宮距離地而74 cm。被測(cè)大鼠在測(cè)試前先在測(cè)試的房間中適應(yīng)30 min,測(cè)試時(shí)有正常的燈光照明。將被測(cè)大鼠放在中心區(qū)域(頭朝向開(kāi)放臂)，讓其自由探索5 min。每只大鼠在迷宮中的活動(dòng)情況由攝像機(jī)拍攝記錄，然后由對(duì)實(shí)驗(yàn)處理不知情者對(duì)錄像進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)動(dòng)物進(jìn)入開(kāi)放臂和封閉臂的次數(shù)(四肢均進(jìn)入臂內(nèi))，以及分別在開(kāi)放臂和封閉臂內(nèi)停留的總時(shí)間。

1.2.2曠場(chǎng)   曠場(chǎng)由上海欣軟信息科技有限公司提供，大小為75 cmX 45 cmX 35cm的有機(jī)玻璃制成的箱子(無(wú)蓋)，將其底板平均劃分成15個(gè)15 cm X 15 cm的格子，中間的3個(gè)方格稱為中央格。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，將被測(cè)鼠輕輕放在曠場(chǎng)一角的格子中(朝向角落)，讓其自由探測(cè)10 min，攝像機(jī)記錄其在此時(shí)間段內(nèi)的所有行為。統(tǒng)計(jì)的指標(biāo)如下:水平運(yùn)動(dòng)能力(所穿越的格子數(shù))、直立次數(shù)(后肢站立，前爪騰空或扶趴曠場(chǎng)壁的次數(shù))、中心時(shí)間(在中心格中停留的時(shí)間)以及潛伏期(從放入到第一次離開(kāi)角落格子的時(shí)間)和休息時(shí)間(四肢站立不動(dòng))。

1.2.3明暗箱  明暗箱由上海欣軟信息科技有限公司提供，由兩個(gè)規(guī)格為35 cm X 25cm X 17 cm的塑料箱組成，中間通過(guò)錫鐵皮管(長(zhǎng)5cm，直徑為5. 5 cm)相連。其中一箱用透明的有機(jī)玻璃板覆蓋，并在盒蓋上方30 cm處放置40 W的燈泡提高亮度，作為明箱;另一箱則用硬紙板密封，阻比光線進(jìn)入，作為暗箱。測(cè)試時(shí)，將待測(cè)鼠放入明箱的中心區(qū)域，任其在明箱和暗箱中自由探究5min。所統(tǒng)計(jì)的參數(shù)包括:潛伏期(從放入到第一次離開(kāi)明箱所需要的時(shí)間)，明箱中累積時(shí)間、暗箱中累積時(shí)間(四肢均進(jìn)入時(shí)，認(rèn)為是進(jìn)入)和兩箱之間的穿越頻次。

每只動(dòng)物測(cè)試完畢，實(shí)驗(yàn)人員都對(duì)所使用的迷宮進(jìn)行擦拭清洗(先用75%的酒精，然后用水)，并用吹風(fēng)機(jī)吹干，以避免前一只大鼠的遺留氣味影響

之后待測(cè)大鼠的焦慮行為水平。

1. 3器官解剖和血液激素的測(cè)定

處理10周后，在上午9: 30-10: 00，采用斷頭的方法處死兩組試驗(yàn)鼠,3 min內(nèi)收集軀干血。血樣在4 000 r/min, 4℃下離心30 min，取得血清。將血清保存在一2 0 0C，以備進(jìn)行皮質(zhì)醇、孕酮和雌二醇的測(cè)定。然后，解剖大鼠的腎上腺、脾臟、卵巢、子宮和包皮腺并稱重，精確到0. 1 mg。相對(duì)器官重量通過(guò)下而的公式計(jì)算相對(duì)器官重一絕對(duì)器官重(g) X100/體重(g) 0血清樣品的激素含量采用Iz} 1放射性免疫測(cè)定的方法進(jìn)行測(cè)定。激素測(cè)定所用的試劑盒均由北京科美東雅生物技術(shù)有限公司提供。人類(lèi)的抗血清具有高度特異性;對(duì)所有標(biāo)準(zhǔn)的激素來(lái)說(shuō)，人類(lèi)抗血清與其他的類(lèi)固醇激素發(fā)生交叉反應(yīng)的可能性小于0.0100;內(nèi)部和相互反應(yīng)的可變性小于7. 4%和10. 0%。

1. 4數(shù)據(jù)分析

首先要采用單樣本KS檢驗(yàn)法對(duì)所測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。對(duì)于正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用雙尾獨(dú)立樣本T檢驗(yàn);對(duì)于非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，則采用Mann Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)都用SPSS 18. 0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著水平定為a=0. 05。

2結(jié)果

2 .1高架迷宮實(shí)驗(yàn)

隔離飼養(yǎng)和群養(yǎng)大鼠在高架十字迷宮測(cè)試中的行為沒(méi)有表現(xiàn)出顯著差異(表m1)

2. 2曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

與四只一籠的群養(yǎng)雌鼠相比，單養(yǎng)的雌鼠在曠場(chǎng)中直立次數(shù)明顯減((t=2.543,P=0.023)，其他行為沒(méi)有顯著差異。中間格子的停留時(shí)間是情緒的重要指標(biāo)，雖然從平均值來(lái)看，兩者有較大差別，但數(shù)據(jù)是非正態(tài)分布，采用Mann Whitney U檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示群養(yǎng)組和單養(yǎng)組之間并沒(méi)有顯著差異(二=0.221,P=0.833)(表2)

2. 3明暗箱實(shí)驗(yàn)

與群養(yǎng)的雌性大鼠相比留時(shí)間顯著增多(Ct= 2. 520,留時(shí)間顯著減少(Ct一2. 524,，單養(yǎng)雌鼠在暗箱中停P = 0. 047)，明箱中停P = 0. 045)，在明暗箱之間穿越次數(shù)明顯減少(總穿越頻次:t = 2. 114,P=0. 049)，潛伏期沒(méi)有差異(二=1.629,P=0.103)(表3)。

2. 4體重和器官重量變化

單養(yǎng)和群養(yǎng)雌性大鼠的試驗(yàn)前初始體重沒(méi)有顯著差異((t=1.290,P=0.210)，但隔離飼養(yǎng)

第1周后，與群養(yǎng)組大鼠相比，單養(yǎng)組大鼠表現(xiàn)出明顯的體重增加(t=2. 570,P=0. 023)，這種

差異一直持續(xù)到隔離飼養(yǎng)的第10周(t=2. 900,P=0 .050)(圖1)。

然而，單養(yǎng)和群養(yǎng)雌鼠之間腎上腺、脾臟、子宮、卵巢和包皮腺的相對(duì)重量并沒(méi)有表現(xiàn)出顯著差異結(jié)果見(jiàn)表40

我們的研究結(jié)果表明長(zhǎng)期社會(huì)隔離使雌性大鼠在曠場(chǎng)中的直立行為減少，在明暗箱測(cè)試中，明箱和暗箱之間穿越次數(shù)減少，并在暗箱中停留時(shí)間增加，說(shuō)明雌性大鼠在長(zhǎng)期社會(huì)隔離中產(chǎn)生了焦慮行為。這與有些早期的研究結(jié)果一致。但Helleman與Zha等的研究結(jié)果卻表明社會(huì)隔離并沒(méi)有使大鼠產(chǎn)生焦慮反應(yīng)。這種差異原因可能是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系、性別差異及實(shí)施隔離的時(shí)間不同引起的。比如，Hellemans用的是雄性I, Evan大鼠，而本實(shí)驗(yàn)選用的是雌性SD品系的大鼠;Hellemans選擇在Long-evans大鼠21 d和66 d

時(shí)進(jìn)行隔離，共隔離飼養(yǎng)了3個(gè)月，Zhao是在SD大鼠21天時(shí)實(shí)施的隔離，共隔離飼養(yǎng)了8周，而本實(shí)驗(yàn)則是在SD大鼠成年的時(shí)候進(jìn)行的隔離，共隔離飼養(yǎng)了10周。根據(jù)以前文獻(xiàn)報(bào)道，社會(huì)脅迫通常會(huì)減少動(dòng)物在高架迷宮中開(kāi)放臂停留的時(shí)間X33 3d}但令人費(fèi)解的是，在高架十字迷宮測(cè)試中，我們并沒(méi)有觀察到隔離大鼠和群養(yǎng)大鼠在行為上的差異。這可能由于高架十字迷宮中的行為參數(shù)比較容易受到各種不確定測(cè)試因素的影響所致，3}};但也可能由于成年SLl雌性大鼠對(duì)曠場(chǎng)和明暗箱測(cè)試更加敏感，具體原因還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

體重方而，我們發(fā)現(xiàn)與群養(yǎng)大鼠相比，社會(huì)隔離僅一周就能使雌性大鼠的體重顯著增加。這可能是因?yàn)楦綦x飼養(yǎng)的大鼠比群養(yǎng)的大鼠進(jìn)食量更大，有研究表明，即使己經(jīng)飽食的隔離飼養(yǎng)大鼠仍然表現(xiàn)出取食行為。另一方而，體重的增加(肥胖)也是判斷嚙齒動(dòng)物產(chǎn)生社會(huì)脅迫的一個(gè)重要指標(biāo)

除了體重增加之外，應(yīng)激、生殖器官重量及相關(guān)激素水平的變化也是動(dòng)物產(chǎn)生脅迫反應(yīng)比較直觀的測(cè)量指標(biāo)[?17。但在我們的試驗(yàn)中，群養(yǎng)組與單養(yǎng)組的腎上腺、脾臟、子宮、卵巢、包皮腺的相對(duì)重量并沒(méi)有表現(xiàn)出差異。這可能是因?yàn)榉Q量器官濕重很容易受到血液含量及附帶組織的干擾。激素的研究結(jié)果表明社會(huì)隔離使血清中皮質(zhì)醇和孕酮降低，表明社會(huì)隔離導(dǎo)致了雌鼠下丘腦唾體一腎上腺軸和下丘腦-垂體Jh}腺軸的調(diào)節(jié)異常，可能會(huì)影響到隔離鼠的代謝、繁殖和免疫等生理功能。我們雖然發(fā)現(xiàn)社會(huì)隔離使雌性大鼠出現(xiàn)了明顯的焦慮行為，但皮質(zhì)醇卻顯著下降，這種行為和激素水平不一致的現(xiàn)象，以往研究中也有出現(xiàn)，比如:高熱應(yīng)激使大鼠焦慮，然而血清皮質(zhì)酮的水平卻下降.當(dāng)糖皮質(zhì)激素水平是正常的時(shí)候，大鼠也常會(huì)出現(xiàn)各種焦慮行為口;創(chuàng)傷后應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致行為和神經(jīng)活動(dòng)的改變，但尿液中皮質(zhì)醇水平卻降低比〕。這或許是因?yàn)榻箲]行為和激素水平測(cè)試的結(jié)果非常依賴動(dòng)物的飼養(yǎng)條件(活動(dòng)空間大小、飼料)、測(cè)試環(huán)境及選擇的測(cè)試方法(依靠單一行為方法無(wú)法準(zhǔn)確推斷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的焦慮水平);還有可能由于動(dòng)物對(duì)長(zhǎng)時(shí)期的應(yīng)激刺激產(chǎn)生了適應(yīng);另外，雌性大鼠的激素水平可能與其所處的動(dòng)情周期也有關(guān)系。

4結(jié)論

本文研究結(jié)果表明，社會(huì)隔離使雌性成年大鼠產(chǎn)生了焦慮行為，并引起隔離大鼠血液中皮質(zhì)醇和孕酮的下降;動(dòng)物長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的獨(dú)居或居的生活方式是決定動(dòng)物馴化過(guò)程中適宜養(yǎng)殖條件的重要因素，人為改變其生活模式可能會(huì)對(duì)其行為和生理產(chǎn)生影響。此研究結(jié)果將有助于進(jìn)一步加深人類(lèi)對(duì)嚙齒類(lèi)動(dòng)物社會(huì)隔離焦慮模型的理解。本研究的局限性在于激素和行為的檢測(cè)雖然排除了動(dòng)情期大鼠，但沒(méi)有認(rèn)真區(qū)分其他動(dòng)情周期比如動(dòng)情間期、動(dòng)情前期和動(dòng)情后期之間的差別。社會(huì)隔離對(duì)處于不同動(dòng)情狀態(tài)雌鼠的影響尚需要進(jìn)一步研究。