薄層色譜點(diǎn)樣選購(gòu)指南、操作技巧、注意事項(xiàng)

薄層色譜點(diǎn)樣

點(diǎn)樣方法

點(diǎn)樣除另有規(guī)定外，用點(diǎn)樣器點(diǎn)樣于薄層板上，一般為圓點(diǎn)，點(diǎn)樣基線距底邊2.0cm，樣點(diǎn)直徑及點(diǎn)間距離同紙色譜法，點(diǎn)間距離可視斑點(diǎn)擴(kuò)散情況以不影響檢出為宜。點(diǎn)樣時(shí)必須注意勿損傷薄層表面。點(diǎn)樣直徑不超過(guò)5mm，點(diǎn)樣距離一般為1~1.5cm即可。樣品在溶劑中的溶解度很大，原點(diǎn)將呈空心環(huán)——環(huán)形色譜效應(yīng)。因此配制樣品溶液時(shí)應(yīng)選擇對(duì)組分溶解度相對(duì)較小的溶劑。點(diǎn)樣方式有點(diǎn)狀點(diǎn)樣和帶狀點(diǎn)樣。

怎樣提高點(diǎn)樣效率?

點(diǎn)樣是造成TLC定量誤差的主要來(lái)源。實(shí)驗(yàn)證明：定量毛細(xì)管更適合較小體積的點(diǎn)樣；微量注射器更適合較大體積的點(diǎn)樣。這主要是因?yàn)槲⒘孔⑸淦魇苄�氣泡、溶液回爬現(xiàn)象的影響較大。為避免不同定量毛細(xì)管間的點(diǎn)樣誤差、建議一塊薄層板上最好用同一只定量毛細(xì)管。但應(yīng)注意更換樣品時(shí)，應(yīng)將毛細(xì)管用超1聲bo或不同極性溶劑清洗干凈。在制備樣品時(shí)，溶樣溶劑黏度不能過(guò)高，以便于點(diǎn)樣；溶劑沸點(diǎn)過(guò)低則進(jìn)樣體積易變，過(guò)高則會(huì)改變展開(kāi)劑組成；對(duì)樣品溶解度過(guò)高會(huì)使樣點(diǎn)發(fā)生空心現(xiàn)象；常用的溶劑為甲醇、乙醇、**。經(jīng)典TLC樣點(diǎn)原點(diǎn)一般為直徑3mm點(diǎn)間距1--2cm 底邊距1.5cm；HPLC樣點(diǎn)原點(diǎn)一般為直徑1mm點(diǎn)間距5mm 底邊距1cm。

 不同溶劑對(duì)樣品的洗脫能力不同，因此在點(diǎn)樣的同時(shí)，樣品在原點(diǎn)開(kāi)始呈環(huán)形展開(kāi)，如果樣品在溶劑中的溶解度很大，原點(diǎn)將變成空心環(huán)，Kaiser稱(chēng)這種現(xiàn)象為“點(diǎn)樣環(huán)形色譜效應(yīng)”。這種效應(yīng)對(duì)隨后的線形展開(kāi)造成不良影響，因此配制樣品溶液時(shí)應(yīng)選用對(duì)組分溶解度相對(duì)較小的溶劑；溶劑的粘度不宜過(guò)高，以便于點(diǎn)樣，溶劑的沸點(diǎn)要適中，沸點(diǎn)過(guò)低由于揮發(fā)會(huì)改變樣品溶液濃度導(dǎo)致較大誤差，沸點(diǎn)過(guò)高，樣品溶液的溶劑會(huì)在原點(diǎn)殘留，導(dǎo)致改變展開(kāi)劑的選擇性，特別是樣品溶液的溶劑與展開(kāi)劑的極性相差較大時(shí)更為明顯，最常用的溶劑為甲醇及乙醇，有時(shí)也用丙酮。點(diǎn)樣后必須將溶劑全部除去后再進(jìn)行展開(kāi)，但要避免高溫加熱，以免改變待測(cè)成分的性質(zhì)。（長(zhǎng)沙德之瑞儀器科技有限公司定量毛細(xì)管）

點(diǎn)樣方式、點(diǎn)樣量及點(diǎn)樣設(shè)備的選擇決定于分析的目的、樣品溶液的濃度及被測(cè)物質(zhì)的檢出靈敏度。

點(diǎn)樣體積經(jīng)典薄層一般為1-5μl，高效薄層為100-500nl，樣品溶液濃度一般在0.01%-1.00%范圍內(nèi)，點(diǎn)樣過(guò)多會(huì)造成原點(diǎn)“超載”，展開(kāi)劑產(chǎn)生“繞行”現(xiàn)象使斑點(diǎn)拖尾或重疊，使掃描峰形不對(duì)稱(chēng)或不能基線分離，并由于超載得到非線性的校正曲線，嚴(yán)重影響定量結(jié)果，降低準(zhǔn)確度。

經(jīng)典薄層的原點(diǎn)直徑最大不得超過(guò)5mm，一般3mm較為合適，高效薄層原點(diǎn)直徑約為1-2mm，盡可能避免多次點(diǎn)樣，原點(diǎn)直徑過(guò)大會(huì)降低分辨率及分離度。

經(jīng)典薄層起始線距底邊約1.5cm，高效薄層為1cm，展距前者為10-15cm，后者為5-7cm，對(duì)于難分離的化合物用多元展開(kāi)劑展開(kāi)時(shí)，注意原點(diǎn)與展開(kāi)劑的距離每次要保持一致，否則由于色譜分離最初行為的差異而導(dǎo)致分離失敗。

點(diǎn)與點(diǎn)的間距經(jīng)典薄層為1-2cm，高效薄層為0.5cm，用具自動(dòng)換行功能的薄層掃描儀時(shí)，斑點(diǎn)之間的距離必須十分精確，才能正確地掃描每行的色斑，得到好的測(cè)定結(jié)果，圖7-3-1為一般的點(diǎn)樣圖解。

在點(diǎn)樣前，應(yīng)將薄層板在日光及紫外光下檢查板面有無(wú)損壞或污染，選擇合格的薄層板后決定用點(diǎn)狀點(diǎn)樣還是用帶狀點(diǎn)樣。為此，瑞士CAMAG公司生產(chǎn)了系列點(diǎn)樣設(shè)備以供選用，這些設(shè)備只適用于硬板。下面是常用的點(diǎn)樣方式及設(shè)備。 （長(zhǎng)沙德之瑞儀器科技有限公司定量毛細(xì)管）

（一）點(diǎn)狀點(diǎn)樣
    如果僅僅為了定性，用內(nèi)徑約0.5mm管口平整的毛細(xì)管或微量注射器將樣品溶液點(diǎn)在距薄層底邊約2cm處，點(diǎn)樣直徑不超過(guò)5mm，點(diǎn)間距約為1-1.5cm即可。
    為進(jìn)行定量，借毛細(xì)作用吸樣的定容管有兩種，一是容積為0.5、1、2、3、4及5μl的德之瑞定量毛細(xì)管（Microcaps），另一種是100及200nl的鉑銥合金定量毛細(xì)管（Nanopipette）；注射器式的可變體積的點(diǎn)樣器有50-230nl的毫微點(diǎn)樣器（Nano-Applicator）及0.5-2.3μl的微量點(diǎn)樣器（Micro-Applicator），用于需要調(diào)節(jié)體積及沒(méi)有毛細(xì)作用的鍵合相薄層的點(diǎn)樣。
    毛細(xì)管式的微量點(diǎn)樣器裝在手動(dòng)的Nanomat型點(diǎn)樣裝置的磁性點(diǎn)樣頭上，點(diǎn)樣頭裝在彈簧上。按下此點(diǎn)樣頭，毛細(xì)管借恒定的壓力接觸薄層表面。點(diǎn)間距離由帶準(zhǔn)確的#44 間隔的E字形缺刻裝置控制，CAMAG Nanomat Ⅲ型手動(dòng)點(diǎn)樣器，適用于普通或高效薄層板，點(diǎn)樣體積精確，樣品原點(diǎn)小，原點(diǎn)間隔定位準(zhǔn)確；注射器式的毫微點(diǎn)樣器及微量點(diǎn)樣器由測(cè)微尺控制，也可與Nanomat型點(diǎn)樣裝置配合，以使點(diǎn)樣位置精確。
    電動(dòng)的Nanomat Ⅲ型點(diǎn)樣裝置完全適用于上述各種點(diǎn)樣器的配套使用，并且還可以自動(dòng)控制點(diǎn)樣次數(shù)，點(diǎn)樣器在薄居上的停留時(shí)間，以及點(diǎn)樣器接觸薄層的速度。還可避免手持毛細(xì)管點(diǎn)樣時(shí)的用力不勻，由于靠機(jī)械控制接觸板面，壓力恒定。此外，還有可以用于環(huán)形展開(kāi)及向心展開(kāi)的薄層點(diǎn)樣裝置。

（二）帶狀點(diǎn)樣
    當(dāng)樣品溶液體積大、濃度稀時(shí)，采用CAMAG Linoamt Ⅳ型自動(dòng)點(diǎn)樣設(shè)備進(jìn)行帶狀點(diǎn)樣。定量分析的點(diǎn)樣范圍為1-99μl，制備型分離點(diǎn)樣范圍為5-490μl，作定量標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，可由同一標(biāo)準(zhǔn)溶液，自動(dòng)點(diǎn)上不同體積的標(biāo)準(zhǔn)液，故快速簡(jiǎn)便，利用內(nèi)裝的微處理器編序操作，簡(jiǎn)單易行。使用時(shí)樣品溶液吸在微量注射器中，點(diǎn)樣器不接觸薄層，而是用氮?dú)鈱⒆⑸淦麽樇獾娜芤捍德湓诒�層上，薄層板在針頭下定速移動(dòng)點(diǎn)成0-199mm的窄帶。帶狀點(diǎn)樣展開(kāi)后的斑點(diǎn)不僅分辨率明顯高于點(diǎn)狀點(diǎn)樣，而且精密準(zhǔn)確，為定量分析提供最佳條件。

（三）自動(dòng)點(diǎn)樣
    Automatic TLC Sampler Ⅲ型（ATS Ⅲ）全自動(dòng)點(diǎn)樣裝置結(jié)合了現(xiàn)代最先進(jìn)的電子及機(jī)械技術(shù)，能進(jìn)行點(diǎn)狀或帶狀點(diǎn)樣，采用先進(jìn)計(jì)算機(jī)編程控制，靈活多用，點(diǎn)樣量為10nl-50μl，可隨意設(shè)定點(diǎn)樣規(guī)范，可應(yīng)用于單向、雙向、環(huán)形或向心色譜展開(kāi)，高度自動(dòng)化的點(diǎn)樣使定量分析結(jié)果準(zhǔn)確。點(diǎn)樣參數(shù)可與Scanner Ⅱ掃描儀的CATS掃描分析軟件連用，令定量分析工作達(dá)到高度自動(dòng)化。

（四）接觸點(diǎn)樣
    當(dāng)樣品溶液粘度較大或點(diǎn)樣體積要超過(guò)100μl時(shí)，用毛細(xì)管點(diǎn)樣就有困難，F(xiàn)enimore設(shè)計(jì)的接觸點(diǎn)樣法適用于這類(lèi)樣品的點(diǎn)樣，美國(guó)制造的Clarke Contact Spotter就是這種接觸點(diǎn)樣器，見(jiàn)圖7-3-2。在帶有抽氣孔的凹形塊的上方覆蓋一片涂有疏水性物質(zhì)的聚氟化物薄膜（a），當(dāng)減壓抽氣時(shí)薄膜凹陷（b），此時(shí)將樣品溶液點(diǎn)在凹槽處（c），然后用氮?dú)獯等ゴ蟛糠秩軇�（d），再將濃縮后的樣品液滴與高效薄層板的吸附劑層接觸（e），此時(shí)樣品就定量地轉(zhuǎn)移到薄層上。

    1988年Kaiser對(duì)以上各種點(diǎn)樣方式進(jìn)行了比較，總結(jié)其優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)表7-3-1、圖7-3-3。

這種微量快速的上樣方法，對(duì)天然化合物及合成高分子化合物的分離和鑒定已成為一個(gè)重要的手段。下村等在中藥厚撲鑒別的研究中應(yīng)用了此法，只需少量樣品即可鑒別厚撲酚（honokiol）；橋本庸平等用此法分離了麻黃堿的旋光異構(gòu)體，管內(nèi)殘?jiān)��?jīng)生物堿檢查呈陰性，證明加熱后麻黃堿的揮發(fā)是完全的。Jolliffe等將含有某些生物堿的藥物，如烏頭、檳榔、顛茄、金雞納、麥角、曼陀羅、麻黃、天仙子、罌粟、蘿芙木、番木鱉等31種植物藥進(jìn)行熱微量抽出法，逸出的揮發(fā)性成分直接點(diǎn)在薄層上，用五種不同展開(kāi)劑展開(kāi)，用羅丹明B及奶油黃為參比物，顯色后對(duì)所分離的生物堿進(jìn)行鑒定。Cheml等將金雞納樹(shù)皮中的生物堿在爐溫300℃時(shí)揮發(fā)至硅膠板上，展開(kāi)后鑒定辛可寧等七種生物堿。Van Meer等成功地用本法分離了纈草根中的纈草素及異纈草素。Liptak等用本法檢驗(yàn)洋茴香、洋甘菊和歐薄荷以及它們的精油類(lèi)成分。

圖7-3-9為FE-TLC示意圖，從高壓氣瓶1出來(lái)的氣體，通過(guò)電動(dòng)隔膜壓縮器6壓至7.0-40MPa，壓縮器和微量萃取器12在恒溫器內(nèi)保持恒溫。萃取器的體積為2ml，被萃取樣品置在其中。先關(guān)閉閥門(mén)11，待高壓提取器內(nèi)氣壓達(dá)到提取壓力，提取過(guò)程達(dá)到平衡后即打開(kāi)。超臨界流體通過(guò)一毛細(xì)管?chē)姵�。由于氣流壓力下降至大氣壓，帶出的提取物析離并吸附在薄層板13上，薄層板與毛細(xì)管出口間距離為1-5mm。點(diǎn)樣后按薄層常規(guī)方法操作。通過(guò)分步提高提取壓力，可以分步提出不同成分。

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