基于 Orbitrap GC-MS 的非靶向代謝組學(xué)

 

Stefan Weidt,2 Bogusia Pesko,2 Cristian Cojocariu,1 Paul Silcock,1 Richard J. Burchmore,2 and Karl Burgess2

1Thermo Fisher Scienti_c, Runcorn, UK

2Glasgow Polyomics, University of Glasgow, Glasgow, UK

 

法醫(yī)學(xué)；代謝組學(xué)；多變量統(tǒng)計分析；Q Exactive GC 系統(tǒng)

 

代謝組學(xué)旨在表征和定量生物系統(tǒng)中的完整小分子代謝通路或代謝物組。代謝物組包含小分子多元混合物（包括氨基酸、糖和磷酸糖、生物胺和脂質(zhì)）。非靶向代謝組學(xué)極具挑戰(zhàn)性，因為其要求定性和定量上百個不同種類化合物，而有關(guān)這些代謝物的經(jīng)驗知識有限。因此，有必要使用一個既可以以非靶向的方式靈敏檢測特定分子，又可以提供精確質(zhì)量數(shù)信息，用于確認未知物并對其進行結(jié)構(gòu)解析的檢測系統(tǒng)。

 

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）基于其自身的優(yōu)點經(jīng)常用于代謝組學(xué)分析，尤其是其色譜分辨率、重現(xiàn)性、峰容量和便于使用的質(zhì)譜庫。GC為非靶向代謝組學(xué)中生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)提供了卓越的色譜分離能力，但是，由于目前缺乏高端質(zhì)譜儀的支持，從而限制了提供用于分析復(fù)雜樣品（例如，哺乳動物的肌肉組織）的動態(tài)范圍、精確質(zhì)量數(shù)和掃描速度。鑒于大部分重要代謝物的極性特征，必須將其衍生化，以使其有效揮發(fā)，從而確保得到良好的色譜分離。代謝組學(xué)分析尤其是臨床代謝組學(xué)要求高通量和先進的自動化技術(shù)。

 

本項研究展示了新型 Thermo Scientific™ Orbitrap™ GC-MS 完整非靶向代謝組學(xué)工作流程，檢測了大鼠模型中的生物標(biāo)記物，以判定其死亡時間。死亡時間（PMI）推斷是法醫(yī)調(diào)查中一項最關(guān)鍵也是最困難的任務(wù)，尤其當(dāng)尸體溫度與周圍環(huán)境溫度達到平衡后。由于當(dāng)前用于確定 PMI 的方法不精確性且以目視檢查尸體為主。因此，建立一種實驗方法，使用耐用生物標(biāo)志物推斷死亡時間可輔助法醫(yī)調(diào)查。

 

該 GC-MS 裝置使用基于 Orbitrap 的檢測器，得到超高質(zhì)量數(shù)分辨率、亞 ppm 質(zhì)量數(shù)精度、寬動態(tài)范圍以及一定的掃描速度，用于有效定量極復(fù)雜代謝組學(xué)樣品。高分辨率、穩(wěn)定的質(zhì)量數(shù)精度和快速的掃描速度是進行穩(wěn)定的數(shù)據(jù)解卷積的關(guān)鍵因素，以檢測重疊 TIC 峰中的化合物，進行非靶向代謝組學(xué)分析。電子轟擊電離（EI）裂解模式也適合基于應(yīng)用廣泛的 NIST 庫和 Wiley 庫進行匹配，以識別化合物，同時為更深入的表征提供精確質(zhì)量數(shù)。

 

 

從各個大鼠腿部肌肉組織切片取樣，以時間順序增加進行尸檢及采樣。采用氯仿/甲醇/水（1:3:1）提取經(jīng)勻質(zhì)的組織切片中的代謝物，在冰塊下孵育 1 小時。蛋白質(zhì)和 DNA 進行離心沉淀。去除上清液，貯藏在 -80 ℃ 條件下備用。

 

移取 200 μL 提取液至 1.5 mL 硼硅玻璃小瓶中，加蓋 9 mm 螺絲蓋。然后，將樣品置于 Thermo Scientific™ Reacti-Vap™ 蒸發(fā)器中，在 30 ℃ 條件下以低流速氮氣流干燥 60 min。以下所有衍生化步驟均采用 Thermo Scientific™ TriPlus™ RSH 自動樣品處理器進行。

 

加入 20 μL 20 mg/mL（w/v）甲氧基胺鹽酸鹽的吡啶溶液至每個干燥小瓶中。將小瓶渦旋 10 秒并在 30 ℃ 條件下孵育 60 min。甲氧基化步驟完成以后，加入 30 μL MSTFA +1% TMCS（N-甲基-N-（三甲基硅基）三氟乙酰胺+1％三甲基氯硅烷）的混合液，進一步渦旋 30 秒。將小瓶置于 45 ℃ 條件下孵育 60 min 進行硅烷化。將樣品冷卻至室溫以備進樣。

 

所有實驗均采用 Thermo Scientific™ Q Exactive™ GC 組合型四極桿 Orbitrap 質(zhì)譜儀進行。采用 TriPlus RSH 自動進樣器進樣，采用 Thermo Scientific™ TRACE™ 1310 GC 色譜儀和 Thermo Scientific™ TraceGOLD™ TG-5SilMS 15 m × 0.25 mm I.D. × 0.25 μm 薄膜毛細管柱（P/N: 26096-1301）進行色譜分離。儀器參數(shù)的其他詳細信息見表 1 和表 2。

 

TRACE 1310 GC 參數(shù)
進樣量（μL）	1.0
襯管	單錐形（P/N 453A1345）
入口（℃）	250
入口模塊和模式	SSL，分流 1:60
載氣（mL/min）	He，1.2
柱溫箱溫度程序
溫度 1（℃）	70
保持時間（min）	2
溫度 2（℃）	325
速度（℃/min）	10
保持時間（min）	8.5

Q Exactive GC 質(zhì)譜儀參數(shù)
傳輸線（℃）	275
電離類型	EI
離子源（℃）	230
電離能量（eV）	70
采集模式	全掃描
質(zhì)量數(shù)范圍（m/z）	50–750
質(zhì)量數(shù)分辨率（m/z 200 時的 FWHM）	60,000
質(zhì)量數(shù)內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量數(shù)（m/z）	207.03235

數(shù)據(jù)分析流程首先使用 MSConvert（ProteoWizard 套件1的一部分）將原始數(shù)據(jù)文件轉(zhuǎn)換為 MzXML 文件。使用 XCMS 包2 和 centWave 算法提取峰。已檢測到的峰以 PeakML 格式輸出，然后使用 MzMatch.R 包對已檢測到的峰進行后處理（過濾每組重復(fù)進樣的最低檢測值、相對標(biāo)準偏差和對 EI 碎片組進行分組的相關(guān)性匹配）。3生成的文本文件輸出使用 IDEOM 軟件4 進行單變量統(tǒng)計處理，使用 SIMCA™ 13.0.35 進行多變量統(tǒng)計處理。使用 Thermo Scientific 解卷積軟件進行峰簇識別和解析。

 

將八只大鼠尸體置于室溫下四天。每日提取肌肉組織進行分析，共檢測 16 個樣品中代謝物濃度的變化以分析尸體分解程度。對樣品進行隨機分析以減小系統(tǒng)誤差。代謝組學(xué)優(yōu)化后的分析流程見圖 1。

 

 

圖 1. Q Exactive GC 系統(tǒng)代謝組學(xué)研究的工作流程。以不同顏色顯示工作流程包中的任務(wù)分工：綠色用于生物技術(shù)人員；橙色用于實驗室技術(shù)人員；紫色用于儀器操作人員；藍色用于生物學(xué)信息處理人員。

 

 

 

圖 2. 大鼠肌肉組織樣品代謝 0–3 天后的 GC-MS 色譜圖（自上而下天數(shù)增加），X 軸為保留時間，Y 軸為強度（固定為1E9 計數(shù)）。例如，記下高亮區(qū)域中峰強度隨時間的變化。

 

Q Exactive GC 系統(tǒng)獲取了每個樣品的全掃描色譜圖（圖 2）。該系統(tǒng)在較寬的動態(tài)范圍內(nèi)采集不同濃度水平代謝物的全掃描色譜圖，不會丟失任何精確質(zhì)量數(shù)信息。使用自動峰選�。ńY(jié)合使用 XCMS 和 MzMatch.R）功能提取每個 EI 峰簇。在該步驟中，已檢測到 1193 個明顯峰簇并進行了初步定量，強度閾值為 100,000。已解卷積峰簇的示例見圖 3。

 

 

圖 3. 已解卷積峰簇被推斷識別為酪氨酸。

 

首先使用單變量統(tǒng)計方法分析結(jié)果。使用 Student's t 檢驗對比每個時間點和時間零點。將每個代謝物的平均 T0 強度設(shè)為 1，倍數(shù)變化顯示為 1 的倍數(shù)值，以方便對比強度明顯不同的代謝物（圖 4 和圖 5）。已檢測到 272 個代謝物的平均強度發(fā)生顯著性變化（P 值小于 0.05），包含已檢測峰簇的定量矩陣示例見表 3。

 

 

圖 4. 發(fā)生顯著性變化代謝物的火山圖。每個代謝物以深藍色菱形表示。強度比（X 軸）是指 T0/T3 時代謝物的倍數(shù)變化，Y 軸顯示代謝物的 P 值。因此，右上方和左上角的代謝物是倍數(shù)變化最大且最具有統(tǒng)計學(xué)意義的代謝物。

 

 

圖 5. 數(shù)據(jù)分析流程的總結(jié)。對原始數(shù)據(jù)進行峰檢測和解卷積（a），然后將其以基峰的形式顯示在 IDEOM 代謝組學(xué)軟件中（b），含定量信息和定量統(tǒng)計方法。IDEOM 軟件也提供定量圖形信息（c），該圖顯示了每種條件下的平均強度和標(biāo)準偏差，本例中每種條件下含四份相同的生物樣品。使用 NIST 庫歸屬目標(biāo)峰，（d）證實了質(zhì)譜數(shù)據(jù)的匹配的結(jié)果，圖下方含已歸屬衍生化氨基酸的Nist分數(shù)值。

 

 

表 3. 已檢測峰簇的定量矩陣。基峰（峰簇中強度最大的峰）、保留時間（RT）和檢測到的最大強度見第 1–3 列。將 T0 的強度歸一化為 1，其他時間點的強度與 T0 強度相比并視情況以不同顏色顯示，見第 4–7 列。第 8–11 列包含每項比值的 T 檢驗 P 值。

 

使用 SIMCA 軟件進行多變量統(tǒng)計分析。5將結(jié)論數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為更為直觀的對數(shù)值，將 Y 類別設(shè)為各時間點，生成數(shù)據(jù)的偏最小二乘判別分析（PLS-DA）模型。該軟件生成分數(shù)圖和載荷圖，以顯示沿著主成分每個時間點的聚類和分離（圖 6）情況。從本次分析可知，死亡后立即取樣的樣品（RAT_T0）聚集在一起，與已分解的大鼠樣品（T1–T3）具有顯著性差異。從 T1–T3 樣品中可以觀察到分組聚類和持續(xù)分解。X 或 Y 軸上的位移表示某一代謝物對分數(shù)圖中樣品群組之間分離的作用大小。在本例中，X 軸將 T0 與 T1–3 分開，Y 軸將 T1、T2 和 T3 分開（圖 6）。載荷圖上的每個藍點表示每個已檢測到的含 EI 碎片離子簇的代謝物（圖 7）。

 

 

圖 6. 分解數(shù)據(jù)的 PLS-DA 模型。該模型為有監(jiān)督多變量分析，將高維數(shù)據(jù)（例如，大量強度不同的代謝物）折疊為涵蓋數(shù)據(jù)集中主要變化的幾種主成分。在本例中，X 軸是主成分 1，Y 軸是主成分 2。注意，本項研究對樣品進行了適當(dāng)聚類，每個群組聚集在一起，T0 已明顯與其他群組分開。

 

 

圖 7. PLS-DA 模型的載荷圖。根據(jù)代謝物（用藍色原點表示）對群組分離的作用大小對代謝物進行聚類分析，見圖 6。例如，最右邊的代謝物對于定義 T0 樣品作用很大。

 

表 4. 分解期間含量不斷增加的代謝物的推定 ID 列表�？梢酝ㄟ^精確質(zhì)量數(shù)和分子式推測進行化合物確認。只有在高分辨率和高質(zhì)量數(shù)精度條件下才能檢測到腐胺，并將其從背景離子中解卷積出來。

 

 

依據(jù)現(xiàn)有商用庫（NIST）識別發(fā)生顯著性變化的代謝物，首先將其與氨基酸、與分解相關(guān)的化合物進行匹配（表 4）�；�于多變量統(tǒng)計分析的整個流程總結(jié)見圖 5，圖中對峰進行了解卷積、定量和識別。所有選擇的化合物得到的分數(shù)均較高（> 700），使用精確質(zhì)量數(shù)進行碎片匹配，從而進一步提高了庫匹配結(jié)果的準確度（表 3）。

 

在此介紹的 Q Exactive GC 系統(tǒng)的工作流程順序為樣品制備、自動衍生化、GC 分離和質(zhì)譜檢測、數(shù)據(jù)分析和結(jié)果報告。這一工作流程使 Q Exactive GC 系統(tǒng)成為揮發(fā)性化合物和需衍生化非揮發(fā)性化合物進行代謝組學(xué)分析的獨特分析工具。

 

卓越的色譜分離能力、可重現(xiàn)的色譜分離結(jié)合快速數(shù)據(jù)采集使 Q Exactive GC 系統(tǒng)成為復(fù)雜代謝組學(xué)分析的理想平臺。

 

超高分辨率、始終如一的亞 ppm 的精確質(zhì)量數(shù)測量為復(fù)雜生物分解基質(zhì)中存在的多種代謝物提供了可靠和高選擇性的分析。

 

較寬的動態(tài)范圍為分析樣品中的代謝物提供高靈敏度和持續(xù)檢測，且質(zhì)量數(shù)精度絲毫不受影響，同時為已檢測到的代謝物提供精確的相對定量。

 

可依據(jù)已有商用庫使用獲得的 EI 數(shù)據(jù)對化合物進行初步識別，使研究人員對結(jié)果進行評價。同時，得到的精確質(zhì)量數(shù)允許對數(shù)據(jù)進一步分析，如使用裂解分析（例如，Mass Frontier）或使AN 10457_C_GCMSMS_201508Y用標(biāo)準品進一步確認目標(biāo)化合物。本例中，氨基酸信號的時間依賴性演變?yōu)闄z測死亡時間提供了一種簡便的生化法醫(yī)分析檢測法。

 

感謝Mark McLaughlin 博士為我們提供了研究用大鼠。

 

1. ProteoWizard Page. http://proteowizard.sourceforge.net/

(accessed Apr. 22, 2015).

2. C.A. Smith, E.J. Want, G.C. Tong, R. Abagyan, and G. Siuzdak. XCMS: Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak Alignment, Matching, and Identification. Anal. Chem.

2006, 78 (3), 779–787.

3. Richard A. Scheltema, Andris Jankevics, Ritsert C. Jansen, Morris A. Swertz, and Rainer Breitling. PeakML/mzMatch: A File Format, Java Library, R Library, and Tool-Chain for Mass Spectrometry Data Analysis. Anal. Chem.

2011 83 (7), 2786–2793.

4. Creek, D.J., Jankevics, A., Burgess, K.E.V., Breitling, R., and Barrett, M.P. IDEOM: an excel interface for analysis of LC-MS based metabolomics data. Bioinformatics.

2012. 28 (7), 1048–1049.

5. SIMCA Page, Umetrics Website. http://www.umetrics. com/products/simca

(accessed Apr. 22, 2015).

 

 

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