Q Exactive Focus 結合 Compound Discoverer實現泮托拉唑雜質譜分析
藥物雜質鑒定新流程 — Q Exactive Focus 結合 Compound Discoverer 實現泮托拉唑雜質譜分析
關鍵詞
藥物雜質鑒定；Compound Discoverer；Q Exactive Focus；靜 電場軌道阱高分辨質譜
1.引言
任何影響藥物純度的物質統稱為雜質。人用藥物注冊技術要求 國際協調會（簡稱 ICH）對雜質的定義為藥物中存在的，化學 結構與該藥物不一致的任何成分。藥物中含有雜質會降低療 效，影響藥物的穩(wěn)定性，有的甚至對人體健康有害或產生其他 毒副作用。因此，檢測有關物質，控制純度對確保用藥安全有 效，對保證藥物質量非常重要。
質譜技術因其快速、高靈敏度和高專屬性的分析能力，已經被廣泛的應用于藥物雜質鑒定，OrbitrapTM 靜電場軌道阱高分辨 質譜具有超高的分辨率和長期穩(wěn)定的高質量精度，可獲得高質 量的一級和多級高分辨質譜數據，保證了鑒定結果的可靠性， 被越來越多的應用于定性分析中。
本文采用Thermo ScientificTM高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱 Q Exactive™ Focus 高分辨質譜聯用技術對藥物泮托拉唑進行 了全面的雜質數據采集，利用高性能四極桿對目標化合物進行 高專屬性選擇，HCD 高能碰撞池進行二級碰撞碎裂，Orbitrap 靜電場軌道阱采集一級和二級高分辨質譜數據。結合 Thermo 新一代的智能小分子化合物分析軟件 Compound Discoverer™， 以高度靈活的自定義方式制定了泮托拉唑雜質分析工作流程（ 圖 1）。
圖 1. 基于 Q Exactive Focus 和 Compound Discoverer 的雜質鑒定流程
2.實驗條件
2.1 液相色譜條件：
儀器：Thermo ScientificTM UltiMateTM 3000 超高效液相色譜儀
色譜柱：Hypersil Gold C18 (100×2.1 mm, 1.9 µm)
流動相：A 為水相：0.1% 甲酸水；B為有機相：乙腈
梯度條件：
2.2 質譜條件
儀器：Thermo ScientificTM Q Exactive Focus 四極桿靜電場軌道阱 高分辨串聯質譜。HESI 離子源參數：Spray Voltage +3.5 KV、2.8 KV，快速正負切換；Sheath Gas Pressure: 40arb；Aux Gas Pressure: 10arb；Capillary Temp: 300℃；Heater Temp: 350℃
質譜掃描參數：全掃描范圍 150–800 m/z，分辨率 70,000 FWHM；二級：Discovery 數據依賴自動觸發(fā)；母離子隔離窗 口 0.4 amu、4.0 amu；分辨率 17,500、70,000 FWHM。
2.3 樣品制備
取泮托拉唑影響因素樣品適量，加乙腈：水（50:50）稀釋至 0.2 mg/mL 后進樣分析。
3．結果
3.1 Q Exactive Focus 提供優(yōu)質、全面、高效的原始數據
3.1.1 快速正負切換提升化合物鑒定覆蓋率
Q Exactive Focus 具有快速、高效的正負切換能力。以圖 2 中 7.16 min 的色譜峰為例，正離子模式下檢測到 336.11500 m/z 雜質的 [M+H]+ 信號，在負離子模式下除了檢測到相應的 334.10177 m/z [M-H]- 信號外，還檢測到另一雜質 320.08543 m/z 的 [M'-H]- 信號，表明快速的正負切換采集模式可以同時 獲得正離子和負離子雜質的全面信息，同時由圖 1 質量偏差可 見，無論是正離子還是負離子模式，Q Exactive Focus 都能保 持優(yōu)秀的質量精度，為準確鑒定提供了有力的保障。
圖 2. 快速正負切換檢測不同性質雜質
3.1.2 更精準的四極桿隔離母離子提升二級譜圖特征性
在做二級碎裂時，需要使用四極桿篩選出母離子，送入碰撞池碰撞碎裂，進而獲得二級高分辨質譜圖，Q Exactive Focus 采用高性 能雙曲面四極桿，具有低至 0.4 amu 的母離子選擇能力，圖 3 比較了不同母離子隔離寬度下雜質 367 m/z 的二級質譜情況，在 4.0 amu 隔離寬度下存在 122、152、184、368 m/z 等離子的諸多干擾，而當隔離寬度縮小到 0.4 amu 時，干擾被有效的去除，同時 從二級質譜響應強度來看，采用 0.4 amu 和 4.0 amu 無明顯差別。表明高性能四極桿能夠在不影響靈敏度的情況下通過提高四極 桿分辨率，更準確的選擇母離子，獲得更特征的二級質譜圖，提高準確鑒定率。
圖 3. 不同隔離寬度下二級質譜數據比對
3.1.3 超高分辨率下獲得特征同位素信息
當質譜的分辨率高到一定程度時，化合物的同位素峰會進一步分離，以泮托拉唑為例（圖 4），在 Q Exactive Focus 高達 70,000 FWHM 的分辨率下，一級質譜中 A2 同位素中的 34S 和 18O+13C2 能得到分離，通過過濾 34S 特征同位素信號，可以從總離子 流圖中篩選出含有 S 元素的泮托拉唑有關物質信號，更有針對性的對有關物質進行鑒定。
圖 4. 分辨率 70,000 FWHM 下泮托拉唑 34S 同位素峰分離和過濾結果
3.2 Compound Discoverer 數據處理軟件發(fā)現及鑒定目標和未知雜質
3.2.1 智能樣品分組比較不同批次樣品
Compound Discoverer 可以針對不同項目建立特定的研究程式，在泮托拉唑研究描述中，輸入針對該項目的分析條件；在研究因 子中根據樣品性質，設立高溫、高濕、常規(guī)條件等三個分類因素；根據分類因素分別對導入的樣品進行定義，進而軟件可以進行 智能分組（圖 5）。
圖 5. Compound Discoverer 泮托拉唑研究程式
3.2.2 靈活自定義的已知和未知雜質數據處理流程
在 Compound Discoverer 工作流程樹中可以根據研究需要，靈活的編輯數據處理的流程。對泮托拉唑的雜質分析，分別采用已知 和未知兩條主要流程對可能存在的預期雜質和未知雜質進行提取處理分析（圖 6）。
圖 6. 雜質分析工作流程樹
3.2.3 雜質提取分析結果快速瀏覽
在 Compound Discoverer 處理結果匯總峰列表中，可以直觀、便捷的查看和篩選預期和未知的雜質峰處理結果，從結果界面中可 以直觀的比對不同影響因素樣品下該雜質的提取離子流圖，進而比較其保留時間及響應情況；在質譜圖中可以評估一級質譜的質 量精度與同位素和理論值的匹配情況（圖 7）。
圖 7. 數據處理結果界面
3.2.4 未知雜質碎片分析和鑒定
在獲得母藥和雜質的一級和二級質譜信息后，軟件將調用碎裂數據庫（Fragmentation Library）快速的對泮托拉唑的碎片結構進行 歸屬，該數據庫幾乎涵蓋了所有已發(fā)表的文獻，保證了碎片解析的準確性。在此研究結果之上，通過軟件對雜質與泮托拉唑二級 質譜信息之間的比對，可進一步對雜質變化位點進行推測（圖 8）。通過 152、185 等共有碎片和 200、216 等特征差異碎片的比 對，推測出該雜質為泮托拉唑砜（圖 9）。
圖 8. 二級質譜碎片歸屬比對結果
圖 9. 雜質泮托拉唑砜
3.3 泮托拉唑雜質分析結果
使用上述解析流程，共檢測到泮托拉唑雜質 15 個，其中可能的降解雜質 9 個，可能的工藝雜質 6 個（圖 10）。
圖 10. 泮托拉唑雜質分類及鑒定結果匯總
4. 小結
4.1 Q Exactive Focus 質譜儀將高性能四極桿與高分辨靜電場 軌道阱 Orbitrap 檢測技術相結合，能夠在保持高質量精度和 靈敏度的前提下進行快速的正負切換，獲得最全面的雜質信 息。高性能四極桿能夠準確快速的篩選母離子，進而獲得高 專屬性的純凈二級質譜圖。Orbitrap 技術具備高分辨高質量精 度（HR/AM）的能力，本實驗中泮托拉唑雜質質量偏差 < 1.5 ppm，能夠準確的生成雜質元素組成，70,000 FWHM 的超高 分辨率可以分辨 A2 同位素中的 34S 和 18O+13C2，更有針對性的 對含 S 有關物質進行鑒定。
4.2 Compound Discoverer 為 Thermo 新一代的智能小分子化 合物鑒定軟件，可針對不同項目建立特定的研究程式。根據 預設的分類因子，對不同影響因素放置條件下的樣品進行便捷 的分組；根據研究需要設定自定義的工作流程樹，對預期的 可能雜質和未知雜質進行提取分析；并在結果瀏覽中直觀的獲 得不同條件下樣品差異比對結果。通過調用豐富的碎裂數據 （Fragmentation Library），可快速的對泮托拉唑碎片結構進 行了準確推測和歸屬，通過對雜質與泮托拉唑二級質譜信息之 間的比對分析，可進一步對雜質變化位點進行推測，最終獲得全面的雜質鑒定結果。
