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TSQ Endura LC-MS/MS與TraceFinder軟件用于440種農(nóng)殘同時定量的高通量分析

瀏覽次數(shù)：3668　發(fā)布日期：2017-2-15　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

一站式流程化農(nóng)殘檢測解決方案：TSQ Endura LC-MS/MS 與 TraceFinder 軟件用于蔬菜基質(zhì) 中 440 種農(nóng)殘同時定量的高通量分析

1.前言

近些年來，此起彼伏的食品安全事件引起了人們強烈的關注，持續(xù)不斷地嚴格加強食品安全監(jiān)管已經(jīng)成為全社會最大的共識，這直接刺激了限量標準更嚴格、體系架構更嚴謹完備的食品安全標準的誕生與升級。在中國，新版GB2763-2014《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》國家標準已正式頒布實施，它連同日本的肯定列表制度（positive list system）、歐盟的EU/EC 指令條例No.752/2014 等一道，共同構成了各國嚴格的食品安全監(jiān)管法規(guī)標準體系。相較于上一版，新國標2763-2014 收錄的農(nóng)殘種類與最大殘留量指標（MRLs）都有了較大的擴容增項，這無疑對相應的農(nóng)殘檢測手段提出了更高更嚴格的技術要求。時至今日，食品安全領域中的工作常態(tài)已然轉變?yōu)閷碗s基質(zhì)中數(shù)百計的多農(nóng)殘項目同時進行高靈敏度、高特異性的高通量檢測，這種業(yè)態(tài)轉變需要質(zhì)譜技術的革新，也需要測試解決方案的完善。

TSQ Endura LC-MS/MS是基于主動離子管控技術（Active Ion Management，AIMTM）開發(fā)的全新一代液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)，它通過S-lens射頻透鏡組、中性粒子擋桿、HyperQuad四極桿、主動離子碰撞池、雙模式離散打拿極檢測器等集成創(chuàng)新（圖1），使得儀器對離子聚焦、傳輸、隔離、碰撞與檢測等離子操控環(huán)節(jié)得以實現(xiàn)了全新突破，賦予了其領先的靈敏度、高達 500 SRM/s 的掃描速度與出色的穩(wěn)健性，從而能全面滿足復雜基質(zhì)中多農(nóng)殘高通量檢測的各種技術挑戰(zhàn)，在食品安全領域中具有廣闊的應用空間與使用價值。

本文展示了一種以 TSQ Endura MS 為平臺、以 TraceFinderTM軟件為流程化驅(qū)動引擎的一站式農(nóng)殘檢測解決方案，并將其用于菜椒基質(zhì)中 440 種農(nóng)殘同時定量的高通量檢測分析。

圖 1. 創(chuàng)新的 TSQ Endura MS 質(zhì)譜儀硬件構造示意圖

1.實驗條件

2.1 樣品制備

實驗使用的農(nóng)殘標樣由Ultra Scientific 公司提供（Rhode Island, USA），440 種農(nóng)殘混標乙腈溶液的母液濃度為 2.5 µg/ mL。

菜椒（bell pepper）空白基質(zhì)由美國California Department of Food and Agriculture 提供，基質(zhì)由15 g 菜椒勻漿物使用15 mL 乙腈，經(jīng)QuEChERS 方法提取獲得。配置基質(zhì)加標樣時,先取適量基質(zhì)加入1.5 倍體積超純水用以改善溶劑效應。再取農(nóng)殘混標，使用乙腈/ 水（v/v, 4/6）逐級稀釋，最后將加水后的空白基質(zhì)與對應濃度點的標樣溶液混合，充分渦旋混勻后，得濃度為0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5… ~200 pg/µL（ppb）的一系列溶液。由低至高，每個濃度點重復進樣三針，用以測試農(nóng)殘在菜椒基質(zhì)中的最低檢測限（LOD）與定量限（LOQ），每個農(nóng)藥的標準曲線在LOQ 到 200 pg/µL濃度區(qū)間內(nèi)繪制。

2.2 色譜分離

反相色譜分離使用Thermo Dionex Ultimate 3000 超高效液相色譜儀完成，配備HPG3400-RS 二元高壓梯度泵（35 µL 小體積靜態(tài)混合器）、WPS-3000TRS 自動進樣器與 TCC-3000RS柱溫箱,色譜條件見下表。

2.3 質(zhì)譜檢測

質(zhì)譜檢測使用TSQ Endura MS 串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀的 tSRM 定時選擇反應監(jiān)測功能（timed Selected Reaction Monitor）進行，配備Easy-Max NGTM HESI 加熱電噴霧離子源。包括保留時間、SRM 離子對、RF 電壓與碰撞能量等在內(nèi)的 tSRM條件，直接從TraceFinder軟件pQuan化學數(shù)據(jù)庫（version 1.0, pesticides Quantitation chemical database）調(diào)用（圖 2）， TSQ Endura MS 儀器方法編輯為拖拽- 釋放式設計，且支持各種方法模板的靈活定制（圖 3）。根據(jù)農(nóng)殘不同的電離屬性，方法中正負電離模式來回切換。依據(jù)不同化學屬性的農(nóng)藥因色譜行為而造成的峰寬不同，設定 tSRM 時間窗口為 1~5 min。除十三嗎啉、丙環(huán)唑等少數(shù)物質(zhì)外，其余絕大多數(shù)設定為 1 min。Q1 與 Q3 分辨率設定為0.7 FWHM，Q2 碰撞池氬氣壓力為 1.5 mTorr。tSRM 掃描循環(huán)時間（cycle time）為 1.2 s。其余質(zhì)譜條件見下表。

圖 2 農(nóng)殘檢測方法 TraceFinder pQuan 化學數(shù)據(jù)庫

圖 3 實驗使用的質(zhì)譜 tSRM 儀器方法模板界面

2.4 數(shù)據(jù)處理

實驗使用TraceFinder 3.2 軟件進行數(shù)據(jù)庫管理、序列采集、數(shù)據(jù)處理以及報告模板自定義與輸出，其靈活強大的功能可為農(nóng)殘檢測的流程化提供一站式服務。尤其，作為面向食品安全常見農(nóng)殘的檢測方法數(shù)據(jù)庫，TraceFinder 中 pQuan 數(shù)據(jù) 庫包含了完備的農(nóng)殘定量與確證信息，以及保留時間、CAS、基本用途等其他相關信息（圖2）。利用pQuan 數(shù)據(jù)庫，實驗無需再使用標樣進行繁瑣的方法優(yōu)化與開發(fā)，而是從數(shù)據(jù)庫中調(diào)取相關的條件，直接進行樣品測定。如圖 4 展示的步驟， TraceFinder 軟件使得同時進行數(shù)百種農(nóng)殘檢測的繁復工作大大清晰地流程化了。

圖 4 TraceFinder 軟件用于農(nóng)殘檢測的流程化工作步驟

3. 結果與討論 TSQ Endura MS 具有業(yè)界領先的 SRM 掃描速度，使用簡便的 tSRM 功能，質(zhì)譜只在給定的時間窗口內(nèi)進行特定離子對的掃描。一方面，這大大提高了質(zhì)譜掃描離子駐留時間（dwell time）的利用率；另一方面，也唯有此才使得在短至20 min的快速梯度內(nèi)同時對數(shù)百余種農(nóng)殘進行高靈敏度檢測成為可能（圖 5）。通過對色譜條件的系統(tǒng)優(yōu)化，從圖 6 散點圖與頻次圖可知，實驗實現(xiàn)了對440 種農(nóng)殘良好的色譜分離，它們均勻地分布在 20 min 有效分離時間窗口內(nèi)，這確保了質(zhì)譜 tSRM 掃描循環(huán)時間可以較為均衡地分配到每個transition 上，改善定量效果。

圖 5 上圖：菜椒基質(zhì)中 440 種農(nóng)殘同時檢測的總離子流圖，下圖：440 種農(nóng)殘的提取離子色譜圖（10 pg/µL）

圖 6（1）農(nóng)殘精確m/z vs. 保留時間散點圖，（2）保留時間的頻次分布圖

TraceFinder 具有豐富強大的數(shù)據(jù)瀏覽、編輯與再處理等功能，能為高通量農(nóng)殘檢測數(shù)據(jù)處理提供全方位的功能支持。圖 7 為 TraceFinder 數(shù)據(jù)結果的一種典型界面，這中間 LC-MS/MS 農(nóng)殘分析的各種信息得以高度凝練地圖形化展示，統(tǒng)全局于一眼，大大有助于提高實際檢測工作中的信息處理效率。同時，這一界面可模板化編輯，具有出色的可擴展性，能滿足不同實驗室的個性化需求。

圖 7 TraceFinder 農(nóng)殘檢測數(shù)據(jù)處理結果的典型界面（Compound View）

實驗嚴格綜合考慮峰面積的變異系數(shù) CV % （LOD 濃度點處三次重復進樣的 CV% 開始穩(wěn)定重現(xiàn)地小于 30%，LOQ 濃度點處小于 20%）、色譜峰形與信噪比等三種因素，確定了 TSQ Endura MS 對菜椒基質(zhì)中 440 種農(nóng)殘進行同時檢測的 LOD 與 LOQ 值，結果見表1。根據(jù)農(nóng)藥化學屬性導致的響應水平不同，LOD在0.005 pg/µL（5 ppt）到 20 pg/µL（20 ppb）之間，LOQ分布在0.01 pg/µL（10 ppt）到 50 pg/µL（50 ppb）范圍內(nèi)，對應的峰面積 CV% 分別為 0.34~29.95% 與 0.43~19.94%。并且，有 430 種農(nóng) 殘的標準曲線相關系數(shù)大于 0.99，顯示 TSQ Endura MS 具有出色的線性。

進一步的統(tǒng)計分析得知，實驗中 440 種農(nóng)殘 LOD 與 LOQ 的中位數(shù)值（median value）分別為0.05 pg/µL（50 ppt）與 0.1 pg/µL（100 ppt），顯示了基于主動離子管控技術研發(fā)的 TSQ Endura MS 具有出色的靈敏度性能。同時，值得注意的是，本實驗為確保分析的高通量性與大多數(shù)農(nóng)殘的檢測效果，使用了單一流動相體系進行快速正負電離切換，一定程度上犧牲了適用于負離子模式的農(nóng)殘的檢測靈敏度（使用乙酸銨體系，會有很大改善）。但盡管如此，如圖 8 所示，對表 1 中的農(nóng)殘 LOD 與 LOQ 值進行頻次分析可知，累計分別有438（占總數(shù) 的 99.5%）與 430 種（占總數(shù)的 97.7%）農(nóng)殘的 LOD 與 LOQ 小于 10 pg/µL 這一國標最低 MRL 限值，同時這也是歐盟法規(guī) 與日本肯定列表制度中的通用標準。本方法實現(xiàn)的 LOQ 全部滿足GB2763-2014強制國家標準中的MRLs指標要求。因此， TSQ Endura LC-MS/MS 是食品安全領域中高靈敏度、高特異性與高通量農(nóng)殘檢測的優(yōu)質(zhì)平臺。