Western Blot常見問題總結

Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，經過PAGE分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反應，再與或標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用于檢測蛋白水平的表達。

關于Western Blot技術，我們實驗室憑著幾年來的豐富經驗，總結出以下幾點建議：

1.抗體的選擇  

對于國內的大多數實驗室來講，做western blot實驗選擇抗體是個頭疼的問題。原因很簡單，買進口抗體捉襟見肘，買國產抗體得需要大無畏的勇氣。在我們實驗室western blot實驗歷程里，我們用過進口抗體，進口抗體國內分裝包裝，國產抗體，質量良莠不齊。 進口抗體一般不會出現閃失：Abcam品種全，質量過硬，但價高；Sigma的價最貴；比較有性價比的是CST的抗體，不足是CST的品種不多。Santa的多克隆抗體質量可以，但是選用Santa的單抗還是有風險，估計這也是業(yè)界共識了吧。

進口抗體國內分裝包裝我們也用過不少，大概好抗體的比例約為50%，如果能做出來，也存在一個問題，就是抗體大多只能用一次國產抗體比較知名的就幾家，但質量確實不敢恭維。Western blot能做出來的確實不多，而且雜帶多，背景不干凈。 

2. Western Blot實驗條件 

具體的試劑配方我們是按寶生物試劑冊的附錄部分配制轉移電泳緩沖液可以回收再用兩次。轉膜我們是300毫安/2小時，轉膜一定得做冰水浴，就是把槽子泡在冰水混合液里。     

3.關于奶粉，膜的選擇 

奶粉看似簡單，其實很重要，如果要湊合，可以到超市買脫脂奶粉。奶粉質量不好，會最終導致顯影要么漆黑一片，要么啥都沒。我們現在用的BD的，很好很穩(wěn)定，可回收利用。 NC膜，PVDF膜我們都用過， PVDF膜的好處是蛋白載量大，韌性好。唯一的麻煩是事先得用甲醇泡幾分鐘，目的是為了增強膜的正電荷。甲醇泡完后，得在轉移緩沖液里泡一兩分鐘。

4 .關于顯色液

我們選用進口超敏ECL顯色液。用普通的顯色液檢測內參一般都沒問題，但對于表達量比較低的蛋白就不容易顯色出來，而超敏的就不一樣，即使蛋白表達量很低，也可以檢測出來。

5. Western Blot實驗關鍵 

Western Blot操作步驟多，每一步的失誤都會造成全盤失敗，綜合而言，抗體仍然是決定成敗的關鍵，如果抗體不好，就是神仙也沒招。其中內參抗體很重要，因為內參抗體的選擇關系到全盤實驗的考評。Actin，Tubulin，GAPDH我們都用過，Actin，Tubulin的缺點是有時候會出現復帶，比較穩(wěn)定的還是GAPDH。如果用心看看cell，nature，science上的文章，大多用GAPDH做內參。進口的，國內分裝的，國產的，我們都用過，效果都還可以。

從western實驗我們總結出，實驗上根本省不下來錢，一個環(huán)節(jié)的爛貨就會導致全盤失敗。對于實驗設計而言，也是如此，一個步驟的疏忽會導致整個實驗立題和評估的邏輯混亂。如果要追求性價比，也就是如何發(fā)揮窮人的勞斯萊斯的最大收益，那從一開始就要按秋后算賬的原則選擇試劑，要算總賬；如果要讓實驗順順利利，那就得注意每一個環(huán)節(jié)，步步為營，細節(jié)決定成敗。到現在，只要抗體work，幾乎沒有我們做不出來的分子，Western給了我們無窮的自信。

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• 免疫共沉淀（CO-IP）
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