使用激光光源進行NIR western blot檢測的優(yōu)勢

簡介

Western blot方法是生物實驗室常用的蛋白檢測方法之一，自從1979提出至今已有數(shù)十年的歷史。用于分析蛋白的表達情況。通過抗原抗體的特異性結合來檢測靶標蛋白，常用的檢測方法有化學發(fā)光法和熒光方法。熒光檢測方法由于可以進行多重檢測且信號穩(wěn)定，越來越受到大家的青睞。二抗直接標記熒光基團，熒光信號強度和目標蛋白濃度成比例關系，而不依賴于酶促反應，定量更準確。NIR近紅外熒光檢測方法，印跡膜自發(fā)熒光較低，信噪比高。NIR熒光檢測能獲得高信噪比和高質量圖片主要依賴于激發(fā)強度大，精密的激光光源和專業(yè)的光學元件。

激光光源相比于LED、氙燈/鹵素燈更容易達到染料的吸收峰

在成像系統(tǒng)中,光源的選擇基于其激發(fā)特定染料的能力，選擇光源的標準是找到一個可以傳遞必要能量的可用激發(fā)光（實際激發(fā)熒光探針的光），同時又可最小化錯誤波長光浪費的標準。激光光源近紅外成像的最大優(yōu)勢在于更接近普通染料的激發(fā)峰。

例如染料 IR Dye® 700 和Alexa Fluor® 680 在685nm處有個最大吸收峰(圖1A, 1B,和 表1).Azure Biosystems cSeries成像系統(tǒng)帶有660nm激光光源，而使用LED或者白光（氙燈和鹵素燈）的激發(fā)光源在630nm左右，染料激發(fā)不完全。

染料IR800和Alexa Flour在780nm有個最大吸收峰（圖1C,D和表1）。Azure Biosystems cSeries帶有785m的激光光源。而使用LED或者白光（氙燈和鹵素燈）的激發(fā)光在最大吸收峰偏左的方向，染料激發(fā)不完全。

窄光譜激光減少光泄露的產(chǎn)生

激光器在所選染料的激發(fā)峰內(nèi)提供強大的、精確的激發(fā)。窄光譜激發(fā)相比于弱的、非特異性的LED和氙燈/鹵素燈白光光源系統(tǒng)可以消除光泄露和人為背景的產(chǎn)生（圖2）。減少圖像噪音，提高信噪比。

激光檢測在更短的時間內(nèi)實現(xiàn)更高的靈敏度

激光光源更接NIR染料的最大吸收峰，并且提供更少的光泄露。那么是如何影響成像的呢？使用羊抗兔的 IR 700標記的抗體孵育進行梯度上樣的印跡膜。印跡膜首先使用LED成像系統(tǒng)曝光30s，然后使用激光成像系統(tǒng)曝光10s（圖3A）。即使成像時間少3倍，在印跡膜上也可以看見同樣數(shù)量的條帶。激光光源更接近染料的吸收峰，幫助用戶節(jié)省成像時間。

激光檢測具有較低的背景

評判數(shù)據(jù)的好壞信噪比是其中一部分，而并不是完全由信號強度決定。節(jié)省時間是其中一個好處，第二個好處是，較短的曝光時間有助于減少背景熒光。信噪比是通過分析每個明亮條帶的信號強度分別除以所選區(qū)域的背景強度所得到（圖3）。短的成像時間可以減少背景，提高信噪比同時具有較好的靈敏度。

總結

激光光源更接近NIR染料的最大吸收峰，激發(fā)強度大具有較少的光泄漏。成像時間短，自發(fā)熒光低，信噪比高等特點。

AzureC600成像系統(tǒng)是市場上唯一即可做激光近紅外、又可以做化學發(fā)光、多色熒光western blotting分析的成像系統(tǒng)，滿足實驗室的各種成像需求。

AzureC150和C200為基礎機型，從C200可升級至c300、c400、c500和c600機型。因此，無需要更換儀器實現(xiàn)UV、可見光、化學發(fā)光、多色熒光和近紅外成像的功能。

參考文獻

1.Towbin, H., Staehelin, T., & Gordon, J. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. PNAS, 76(9), 4350–4354.

2. http://www.coherent.co.jp/document/whitepaper/bio/Lasers_vs_ LEDs_LaserAdvantage_no2_Spectral_Brightness.pdf