YIJI基質金屬蛋白酶（MMP）明膠酶譜法電泳分析試劑盒產品說明書（中文版）

YIJI基質金屬蛋白酶（MMP）明膠酶譜法電泳分析試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

YIJI基質金屬蛋白酶（MMP）明膠酶譜法（gelatin-zymography）電泳分析試劑是一種旨在通過明膠聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法，在分離、蛋白復性、底物水解、染色等一系列步驟下，觀察并半定量深藍色背景中的無色清晰的基質金屬蛋白酶條帶，根據分子量確定特異基質金屬蛋白酶及其活性的權威而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種細胞萃取樣品（動物、人體、植物、昆蟲等）、培養(yǎng)上清懸液、血清和關節(jié)滑液或腦脊液等基質金屬蛋白酶-2，9，以及13等活性及其抑制劑的檢測。產品即到即用，性能穩(wěn)定，操作便捷，敏感度高，條帶清晰，重復性好。

技術背景

基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一類結構高度同源的分泌型或膜相關性鋅內肽酶的總稱，因含有金屬（鋅、鈣）離子而得名。其功能在于分解細胞外基質成分。迄今為止發(fā)現的MMPs至少有28種，幾乎能降解除多糖以外的全部細胞外基質（extracellular matrix）成分，同時參與胚胎發(fā)育、形態(tài)形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、組織再吸收（tissue resorption）、疾病發(fā)生，例如關節(jié)炎、癌細胞浸入轉移等。根據降解的底物不同可將MMPs分為4大類：（1）膠原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和蛋白多糖；（2）明膠酶（Ⅳ型膠原酶）：MMP2、MMP9，又稱明膠酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和彈性纖維；（3）基質溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11，主要作用于纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、彈力纖維、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ膠原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金屬蛋白酶：MT₁-MMP、MT₂-MMP、MT₃-MMP，主要作用于明膠、Ⅳ型膠原、MMP2。體內絕大多數細胞并不儲備MMPs，當需要MMPs的信號傳遞到細胞后才臨時合成，合成的MMPs以無活性的酶原（proenzyme）形式分泌到細胞外，隨后被多種蛋白酶和非蛋白酶水解以及熱處理激活，一種激活的MMPs可激活另一種MMPs，形成瀑布效應。明膠酶譜法（gelatin-zymography）電泳分析技術具有簡便，無需抗體，同步觀察多種酶以及活化與否的優(yōu)勢

產品內容

YIJI膠體液（Reagent A） 100毫升

YIJI凝結液（Reagent B）   3毫升

YIJI促進液（Reagent C） 500微升

YIJI膠頂液（Reagent D）  25毫升

YIJI電泳液（Reagent E） 250毫升

YIJI上樣液（Reagent F）   1毫升

YIJI復性液（Reagent G）  50毫升

YIJI消化液（Reagent H）  50毫升

YIJI染色液（Reagent I） 250毫升

YIJI祛色液（Reagent J） 250毫升

YIJI終止液（Reagent K） 250毫升

產品說明書       1份

保存方式

保存YIJI凝結液（Reagent B）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里； YIJI膠體液（Reagent A）、YIJI促進液（Reagent C）、YIJI膠頂液（Reagent D）、YIJI上樣液（Reagent F）、YIJI染色液（Reagent I），避免光照，有效保證6月

用戶自備

無離子水：用于稀釋濃縮型試劑溶液

1.5毫升離心管：用于樣品處理的容器

15毫升錐形離心管：用于膠體溶液配制的容器

50毫升錐形離心管：用于膠體溶液配制的容器

培養(yǎng)箱：用于孵育反應物

電泳儀：用于蛋白樣品電泳分離

平式搖蕩儀：用于孵育和混勻反應

實驗步驟

實驗開始前，移取50毫升YIJI電泳液（Reagent E）到500毫升容器里，加入450毫升用戶自備的無離子水，混勻后，標記為YIJI電泳工作液。同時將YIJI膠體液（Reagent A）、YIJI凝結液（Reagent B）、YIJI促進液（Reagent C）和YIJI膠頂液（Reagent D）放進25℃恒溫水槽預熱。然后進行下列操作。

• 移出20毫升YIJI膠體液（Reagent A）到50毫升錐形離心管里
• 加入400微升YIJI凝結液（Reagent B）
• 加入40微升YIJI促進液（Reagent C）（注意：如果凝結過快，可以適量減少YIJI凝結液（Reagent B）和YIJI促進液（Reagent C））
• 混勻后，即刻移入玻璃槽，避免氣泡
• 在室溫下孵育45分鐘，或直至膠體凝結
• 移出5毫升YIJI膠頂液（Reagent D）到15毫升錐形離心管里
• 加入100微升YIJI凝結液（Reagent B）
• 加入10微升YIJI促進液（Reagent C）（注意：如果凝結過快，可以適量減少YIJI凝結液（Reagent B）和YIJI促進液（Reagent C））
• 混勻后，即刻移入玻璃槽，避免氣泡
• 插入0.75毫米厚的10孔梳
• 在室溫下孵育45分鐘，或直至膠體凝結
• 將玻璃槽移入到電泳槽里
• 加入適量的含有YIJI電泳液（Reagent E）的YIJI電泳工作液
• 小心拔去10孔梳
• 用吸管或1毫升槍頭沖洗樣品孔備用
• 從－70℃冰箱里取出待測樣品（注意：樣品須澄清；參見注意事項3）
• 移取10微升樣品（20微克總量）到1.5毫升離心管
• 加入10微升YIJI上樣液（Reagent F），混勻
• 室溫下靜置10分鐘
• 小心移取20微升樣品到玻璃槽的樣品孔里（包括用戶自備的蛋白標準樣）
• 電泳運行1至2小時，電壓為125伏，直至染料前沿到達膠底處
• 關閉電源，取出玻璃板，小心拆開，避免損壞膠體
• 放進塑料盒
• 加入90毫升用戶自備的無離子水到塑料盒里
• 加入10毫升YIJI復性液（Reagent G）
• 室溫下，平放在平式搖蕩儀上孵育1小時，速度為50RPM
• 小心倒掉復性液
• 加入90毫升用戶自備的無離子水到塑料盒里
• 加入10毫升YIJI消化液（Reagent H）
• 放進37℃培養(yǎng)箱里，在平式搖蕩儀上孵育20小時，速度為50RPM（注意：如果酶活性過低，可以延長孵育時間至40小時）
• 小心倒掉消化液
• 加入50毫升用戶自備的無離子水到塑料盒里
• 加入50毫升YIJI染色液（Reagent I），混勻
• 室溫下，平放在平式搖蕩儀上孵育60分鐘，速度為50RPM
• 小心倒掉染色液
• 加入50毫升用戶自備的無離子水到塑料盒里
• 加入50毫升YIJI祛色液（Reagent J），混勻
• 室溫下，平放在平式搖蕩儀上孵育30分鐘，速度為50RPM，或直至可見藍色背景下白色清晰的條帶（注意：避免過度去色）
• 小心倒掉祛色液
• 加入50毫升YIJI終止液（Reagent K）
• 進行拍照記錄或成像儀處理和半定量分析：

注意事項

• 本產品為5次（45個樣品）操作 
• 操作時，須戴手套
• 樣品準備要點如下：
  • 必須澄清，至關重要：4℃高速離心5分鐘，速度為10000g，置于－70℃保存待測
  • 樣品中避免使用EDTA、EGTA等二價陽離子鰲和劑以及巰基乙醇和DTT等
  • 樣品中避免使用硫醇抑制劑（THIOL INHIBITOR）
  • 由于TIMP等天然抑制劑的存在，血清樣品中的基質金屬蛋白酶活性很低，可以使用活化劑（建議使用YIJI膠原酶潛酶活化劑（APMA）－YIJI12197）
  • 如果驗證樣品中基質金屬蛋白酶，可以使用抑制劑EDTA對照
  • 避免培養(yǎng)細胞上清樣品顯示黃色，表明已經過于酸性，須調整pH為中性方可使用
• 膠體和膠頂配制前，須25℃預熱相關試劑
• 電泳前注意清洗樣品孔
• 電泳運行，注意安全
• 染色時，避免光照
• 染色后顯示的亮帶PRO－MMP9（92Kd）、淺帶MMP9（82Kd）、亮帶PRO－MMP2（72Kd）、亮帶MMP2（62Kd）的條帶：在深藍色背景下的白色條帶
• 有時會出現多條帶（multiple bands），表明酶的降解產物
• 本公司提供系列基質金屬蛋白酶酶譜檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩(wěn)定
• 本產品經鑒定條帶清晰