組織ADP/ATP比值生物發(fā)光法檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明

組織ADP/ATP比值生物發(fā)光法檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（中文版）

主要用途

組織ADP/ATP比值生物發(fā)光法檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)螢火蟲(chóng)熒光素酶反應(yīng)系統(tǒng)，熒光素在酶的催化下，與ATP發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生生物光能，采用冷光儀測(cè)定其相對(duì)冷光單位的變化，來(lái)定量分析丙酮酸激酶處理前后獲得的組織樣品（包括裂解或懸液）中ADP/ATP比值的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織（動(dòng)物、人體）樣品的ADP/ATP比值（ratio）檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

技術(shù)背景

腺嘌呤核苷酸（adenine nucleotides），簡(jiǎn)稱腺苷，包括單磷酸腺苷、二磷酸腺苷和三磷酸腺苷，是一種單體單位，為核糖核酸（RNA）和脫氧核糖核酸（DNA）的組成成分，并提供化學(xué)能量，在能量代謝通路中維護(hù)諸如肌肉、胞膜等組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生化和生理功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞糖酵解、三羧酸循環(huán)、電子傳遞系統(tǒng)、氧化磷酸化活動(dòng)。腺嘌呤核苷酸在細(xì)胞中濃度低，且不穩(wěn)定，通常通過(guò)其類型不同、濃度差異、分布狀況，來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞的代謝情況和能量狀態(tài)。二磷酸腺苷（adenosine diphosphate；ADP），參與ADP-ATP循環(huán)，提供熱能轉(zhuǎn)換和動(dòng)態(tài)平衡，尤其在線粒體需氧呼吸、光合成等實(shí)現(xiàn)。三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate；ATP）存在于所有代謝活躍的細(xì)胞內(nèi)，是細(xì)胞活力的標(biāo)志。一旦細(xì)胞凋亡或壞死，ATP濃度急遽下降。ADP/ATP比值（ADP/ATP ratio）常用于區(qū)分細(xì)胞死亡與存活的方式：繁殖、凋亡、壞死。在細(xì)胞活力和藥物發(fā)現(xiàn)研究中廣泛運(yùn)用。螢火蟲(chóng)熒光素酶（Firefly luciferase）是62 kd 的單體蛋白，催化ATP依賴性熒光素（luciferin）的氧化，經(jīng)過(guò)電子轉(zhuǎn)移，將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為氧化型熒光素（oxyluciferin）的光能，與ATP量成線性正相關(guān)。首先通過(guò)生物發(fā)光儀（560nm）檢測(cè)，定量ATP濃度，而后在丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）的存在下，將ADP轉(zhuǎn)化為ATP后，再次通過(guò)生物發(fā)光儀檢測(cè)，以定量ADP濃度，最終獲得ADP/ATP比值。其反應(yīng)方式為：

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）  毫升

裂解液（Reagent B）  毫升

緩沖液（Reagent C）  毫升

反應(yīng)液（Reagent D）  微升

轉(zhuǎn)化液（Reagent E）  微升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)     1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照和反復(fù)凍融；有效保證3月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

黑色96孔板：用于冷光檢測(cè)操作的容器

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

冷光儀：用于樣品冷光檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)步驟

• 待測(cè)樣品準(zhǔn)備

• 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個(gè)液氮凍存管
• 即刻放進(jìn)液氮罐過(guò)夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
• 加入置于冰槽里的xx微升裂解液（Reagent B） 
• 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 放進(jìn)冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆?/EM>）
• 即刻放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心移取上清液到新的無(wú)菌的1.5毫升離心管
• 放進(jìn)－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里備用