【干貨】抗體藥的漸變之路

圖1. 自1993年FDA批準(zhǔn)的創(chuàng)新藥物^[2]

    抗體治療藥物的發(fā)展如此氣勢(shì)磅礴，小編在這里得給大家提兩位大師，美國的生物學(xué)家Gerald Edelman 和英國的生物化學(xué)家Rodney Porter，因他們研究發(fā)現(xiàn)了抗體片段的原子分辨率結(jié)構(gòu)，在1972年被授予了諾貝爾獎(jiǎng)（圖2）隨后GeorgesJ. F. Kohler和Cesar Milstein兩位科學(xué)家以此為基奠，利用雜交瘤技術(shù)獲得了單克隆抗體（mAb），進(jìn)而開啟了現(xiàn)代抗體的工程時(shí)代。
 

Gerald Maurice Edelman    Rodney Porter

 圖2. 1972年諾貝爾獎(jiǎng)獲得者^[3,4]

單克隆抗體制備經(jīng)典流程

單克隆抗體的產(chǎn)生得益于雜交瘤技術(shù)的發(fā)展，那么單克隆抗體是如何制備的呢？下面小編給大家簡(jiǎn)單概括一下，如圖3所示：

①將抗原注射到小鼠體內(nèi)，幾周后取出脾臟并提取脾細(xì)胞；

②，③，④將小鼠的脾細(xì)胞與骨髓細(xì)胞融合以產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞，每個(gè)雜交瘤細(xì)胞無限地產(chǎn)生相同的抗體，然后使用抗原/抗體測(cè)定法篩選雜交瘤細(xì)胞，鎖定那些能產(chǎn)生預(yù)期抗體的細(xì)胞；

⑤細(xì)胞也可以冷凍并保存以備后用。這種制備流程很好用，可以比較容易地產(chǎn)生大量相同的特異性抗體；

⑥將產(chǎn)生優(yōu)選抗體的雜交瘤細(xì)胞再集合重新篩選多次，直至分離出純系；

⑦，⑧這些細(xì)胞還可以在培養(yǎng)物中生長或注射到小鼠體內(nèi)以誘導(dǎo)腫瘤。
 

圖3. 雜交瘤法生產(chǎn)單克隆抗體流程圖^[5]

雖然上述方法已證明是穩(wěn)健的并且仍廣泛用于產(chǎn)生單克隆抗體，但在臨床應(yīng)用上卻出現(xiàn)了一定限制。 

圖片來源：soogif

    別急，別急，小編來告訴你。

    因?yàn)樵缙谑褂玫腂淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞來自小鼠，所產(chǎn)生的抗體來自小鼠的基因組（稱為“鼠抗體”），它們?cè)谌梭w中具有免疫原性，人體免疫系統(tǒng)會(huì)將鼠的mAb識(shí)別為外來抗原并產(chǎn)生免疫應(yīng)答（稱為HAMA效應(yīng)）。

進(jìn)入人體內(nèi)的小鼠單克隆抗體很快就會(huì)從循環(huán)中排出，在某些情況下也會(huì)發(fā)生過敏反應(yīng)。此外，小鼠mAb的恒定區(qū)（部分免疫細(xì)胞識(shí)別部分）不能正常與負(fù)責(zé)抗體作用的人類細(xì)胞上的受體相互作用。因此，小鼠單克隆抗體很少產(chǎn)生對(duì)人體所需的治療效果，并且可能不安全。此后，科學(xué)家們紛紛開始向著mAb具備“人性化”的方向而努力。有一個(gè)很簡(jiǎn)單的解決方案就是使用人的B淋巴細(xì)胞代替小鼠的B淋巴細(xì)胞，但這并不奏效，因?yàn)橐环矫妫?/span>來自人細(xì)胞的雜交瘤是不穩(wěn)定的，人B細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生針對(duì)人體組織的抗體；另一方面，用一些抗原來免疫人類會(huì)帶來安全與倫理道德問題。^[6]

人鼠嵌合，人源化與全人單克隆抗體的開發(fā)

為了得到能夠應(yīng)用于臨床上的mAb，科學(xué)家們堅(jiān)持不懈的開發(fā)抗體。到目前為止，已開發(fā)出三個(gè)關(guān)鍵類型的抗體（圖4）：人鼠嵌合抗體（小鼠的可變區(qū)+人的恒定區(qū)），人源化抗體（小鼠CDR區(qū)+人的Igscaffold）和全人單克隆抗體（全人氨基酸）。^[7]
 

圖4. 單克隆抗體結(jié)構(gòu)與類型^[7]

• Rituximab是嵌合mAb，其在臨床上用于治療非霍奇金淋巴瘤。不幸的是，小鼠可變區(qū)在許多情況下仍然被認(rèn)為是外來的，這使得嵌合mAb的應(yīng)用得到了一定的限制。^[6-7]

• Alemtuzumab是人源化單克隆抗體，一種白血病抗癌新藥。人源化單克隆抗體在可變區(qū)域內(nèi)，人類序列與小鼠序列之間存在進(jìn)一步的交換，從而進(jìn)一步降低免疫原性。但人源化單克隆抗體中存在鼠單克隆抗體殘留的CDR ，這些抗體通常失去了它們的結(jié)合活性。理想的情況是在可變區(qū)域中減少鼠源殘基，用以產(chǎn)生功能性而非免疫原性的人源化單克隆抗體。^[6-7]

• 全人抗體的出現(xiàn)：為了消除上述所有種類單克隆抗體的免疫原性問題，偉大的科學(xué)家們開始對(duì)小鼠B淋巴細(xì)胞進(jìn)行改造，其抗體的所有部分改造成完全的人類基因。當(dāng)這些小鼠被免疫時(shí)，它們的免疫反應(yīng)將完全由人類抗體組成。再配合使用標(biāo)準(zhǔn)的雜交瘤技術(shù)從這些小鼠的B淋巴細(xì)胞中獲得完全的人單克隆抗體。^[6-7]哇哦！這種“四兩撥千斤”的做法簡(jiǎn)直是“鬼斧神工”了，有木有？
   

  可替代雜交瘤技術(shù)的抗體篩選方法

  說了這么多，小編想問問小伙伴們，除了上面介紹的利用雜交瘤技術(shù)獲得抗體外，還有其他方法嗎？  

  

  圖片來源：網(wǎng)絡(luò)

  ·     噬菌體抗體庫展示技術(shù)-scFv單鏈抗體的篩選

   噬菌體展示是一種替代雜交瘤的篩選方法，與雜交瘤相似，起點(diǎn)是免疫動(dòng)物的B淋巴細(xì)胞。主要篩選流程：

  1. 提取B-淋巴細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA首先提取，使用與抗體基因保守的引物，通過PCR的方法擴(kuò)增抗體基因，構(gòu)建文庫；

  2. 利用基因工程將編碼多肽或蛋白文庫的DNA序列插入到噬菌體的外殼蛋白基因，多肽或蛋白就可以在噬菌體的表面上表達(dá)出來；

  3. 噬菌體再轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞內(nèi)，成熟后，從宿主中釋放出來；

  4. 用固定有靶蛋白的培養(yǎng)板捕捉能特異結(jié)合靶蛋白的噬菌體；

  5. 洗去未與靶點(diǎn)結(jié)合的噬菌體；

  6. 將與靶點(diǎn)結(jié)合的噬菌體洗被脫下來，再感染宿主細(xì)胞，繁殖擴(kuò)增，進(jìn)行下一輪淘選；經(jīng)抗體片段在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)與免疫分析（包括ELISA或流式細(xì)胞術(shù)）就可以得到想要的高親和性抗體。^[8,10]

  

  圖5. 噬菌體抗體庫進(jìn)行scFv抗體篩選流程圖^[8]

  那么，這么做有什么好處呢？

  首先，并不是所有文庫中表達(dá)的蛋白質(zhì)表位都是有用的，這樣可以篩選感興趣的表位，以保證候選藥物的活性最佳；

  其次，在體外實(shí)驗(yàn)中，可以篩選人源與非人源靶點(diǎn)，這就節(jié)省了臨床前試驗(yàn)的時(shí)間。

  當(dāng)然，體外篩選方法還有cDNA展示技術(shù)進(jìn)行單域抗體(VHH)的體外篩選，核糖體展示技術(shù)篩選高親和力抗體scFv片段，外周血抗原特異性B淋巴細(xì)胞的測(cè)序及親和力測(cè)定等^[1]，小編就不在這里詳細(xì)贅述了。

  ·     迅捷可靠的藥物篩選途徑 （藥效篩選）

   經(jīng)過上述體外篩選后，我們可以拿到一系列具有結(jié)合活性的抗體克隆，那么這些抗體克隆哪個(gè)才是最好的呢？

  此時(shí)，我們需要在體外對(duì)這些抗體進(jìn)一步做親和力分析，各種體外活性測(cè)試（ADCC，CDC等）和理化性質(zhì)分析，選擇出一款具備良好作用效果的抗體。

  當(dāng)然，還有一種行之有效的辦法可以替代這些體外活性測(cè)試，那就直接利用建立腫瘤模型的免疫檢查點(diǎn)人源化小鼠在最初階段對(duì)抗體進(jìn)行篩選，獲得體內(nèi)藥效最好的分子！如圖6所示，將CMC階段G抗體進(jìn)行不同劑量的體內(nèi)藥效測(cè)試（靶點(diǎn)小鼠+MC38腸癌細(xì)胞系），依然具有較好的治療應(yīng)答。如此，便能通過體內(nèi)藥效拿到一款優(yōu)秀的人源抗體候選藥物，溜得飛起有木有？！

  

  圖6. CMC階段抗體體內(nèi)驗(yàn)證（數(shù)據(jù)來源：百奧賽圖）

  好了，今天小編就為大家科普到這。百奧賽圖抗體藥物研發(fā)服務(wù)平臺(tái)，擁有高效的免疫方法，完整的先導(dǎo)抗體篩選過程，可利用各種靶點(diǎn)人源化小鼠對(duì)抗體進(jìn)行體內(nèi)藥效篩選；平臺(tái)還可對(duì)抗體進(jìn)行工程化改造，體外活性測(cè)試以及理化性質(zhì)分析等。如您有任何疑問，歡迎在下方留言，小編會(huì)及時(shí)回復(fù)噠~

  參考文獻(xiàn)

  [1]Roland Kontermann ,Stefan Dübel. Antibody Engineering. Methods andProtocols hird Edition.2018.

  [2]Asher Mullard.2018 FDA drug approvals. Nature Reviews Drug Discovery 18, 85–89

  [3]https://baike.baidu.com/item/杰拉爾德·埃德爾曼/9559195?fr=aladdin

  [4]https://de.wikipedia.org/wiki/Rodney_R._Porter

  [5https://cellbiology.med.unsw.edu.au/cellbiology/index.php/file:Preparation_of_mAbs.jpg

  [6https://cellbiology.med.unsw.edu.au/cellbiology/index.php/Group_7_Project_-_Monoclonal_Antibodies#cite_note-hansel-15

  [7]Hansel,Trevor T.etal.The safety and sideeffects of monoclonal antibodies. NatureReviews Drug Discovery 2010, 9 (4), 325-38 DOI: 10.1038/nrd3003.

  [8]Frenzel A, Schirrmann T, Hust M Phage display-derived human antibodies in clinical developpment and therapy. MAbs. 2016 Oct;8(7):1177-1194. Epub 2016 Jul14.

  [9https://www.soogif.com/materialPage_baidu/r2Ch3hYz7LGDJWaYfdQT84UlwyT3CVGa9O3QF5i1pXVmhdn-MmF4MDDirMz1PWFa

  [10]https://wenku.baidu.com/view/da12be2d0722192e4536f615.html