糖蛋白標志物研究工具——凝集素芯片

 
       糖基化是Z為廣泛和復雜的蛋白質共翻譯或翻譯后修飾之一，它是通過糖基轉移酶，在新生多肽或者成熟蛋白質的特定氨基酸上添加多個單糖的過程，通俗的理解就是在細胞器內“出廠”的蛋白質上添加各種糖鏈“標簽”的過程。人體內至少50%的蛋白質都會發(fā)生糖基化修飾。這類修飾與蛋白質的正確折疊、構象穩(wěn)定性及分泌等密切相關，并影響多種生理學過程，如分子間識別、細胞的粘附、免疫反應、腫瘤的侵襲轉移等。
 

 這樣一種重要的修飾“標簽”不僅會因蛋白質本身的動態(tài)多樣性而在不同類型的樣本中呈現(xiàn)豐度和類別差異，還會因各種生理或病理條件而在同類型的樣本中發(fā)生變化，表現(xiàn)出高度的復雜性和異質性。那么有沒有一種工具可以在全局的角度，快速地描繪出樣本總體的糖基化修飾圖譜呢？答案是——凝集素芯片。 
 

 上海兒童醫(yī)學中心檢驗科楊藺主任與華盈生物研發(fā)團隊、上海交通大學陶生策教授課題組一起展開合作，以社區(qū)獲得性肺炎為研究對象，通過凝集素芯片篩選血清糖基化譜，進一步結合質譜分析，找到潛在的肺炎血清診斷糖蛋白標志物HPR，有助于對兒童非細菌性肺炎與細菌性肺炎的鑒別診斷，相關研究成果于6月12號在線發(fā)表在學術期刊《Proteomics - Clinical Applications》上。

       

        
         該研究的論文作者有多名來自華盈生物研發(fā)團隊，成功應用了華盈生物新建立的凝集素芯片-標志物研發(fā)方案 ，綜合了蛋白芯片與質譜兩種蛋白組學技術，為復雜疾病的臨床標志物開發(fā)提供了新的研究思路，具有借鑒意義。也充分體現(xiàn)了華盈生物專業(yè)化技術服務的理念與研發(fā)實力。

 

研究思路解析：

 

 

第1步：明確研究目的

社區(qū)獲得性肺炎(community acquired pneumonia, CAP)是兒童（尤其是嬰幼兒）常見感染性疾病，也是5歲以下兒童死亡的首位病因。CAP常見病原體包括細菌、病毒、支原體、衣原體等。但不同病原體感染的嬰幼兒早期癥狀無明顯差別，傳統(tǒng)的診斷方法存在不足，難以實現(xiàn)早期及時有效的診斷，因而臨床上以經驗性的廣譜抗生素治療為主，導致耐藥以及部分患兒未及時針對性用藥而延誤病情的風險增加。因此臨床上兒童肺炎尚缺乏有效的早期鑒別診斷標志物。

 
第2步：凝集素芯片助力血清糖基化譜篩選

前面提到，由于蛋白糖基化修飾的廣泛性，無論病理條件下特定蛋白本身數(shù)量發(fā)生變化，還是糖基轉移酶調控的修飾程度、類型發(fā)生變化，都可能導致樣品中糖鏈“標簽”的差異累積并呈現(xiàn)在整體水平上。而凝集素就是一種可以識別這類“標簽”的工具蛋白，制備成蛋白芯片后大大提高了可以同時檢測的“標簽”通量（詳見后文介紹），因此研究人員從蛋白糖基化篩選入手，應用凝集素芯片對正常兒童(NC)、支原體肺炎患兒(M)和細菌性肺炎患兒(B)的血清糖基化譜進行篩選。芯片結果顯示，有4個凝集素（CALSEPA、MIA、PAA 、SNA-I）在不同組間有明顯的差異結合信號，在總體水平上反映出不同血清樣品中特定蛋白糖鏈的豐度差異。
 

 

圖1 凝集素芯片篩選糖基化譜

 
第3步：凝集素芯片結果驗證與延伸

其中，研究人員選取SNA-I進行l(wèi)ectin blot實驗對篩選結果進行驗證。和芯片檢測一致，結果顯示支原體肺炎組檢測信號明顯高于正常對照組和細菌性肺炎組。進一步發(fā)現(xiàn)，差異結合信號集中在42 kDa分子量附近，推測該分子量附近的蛋白可能有糖基化的上調或者蛋白表達量的上調。因此研究人員結合考馬斯亮藍染色結果進行分析，發(fā)現(xiàn)支原體肺炎組中42 kDa附近蛋白表達量有明顯增加，并且和SNA-I的結合信號差異相關性很高（見圖2），由此推測SNA-I結合信號的差異可能是由于42 kDa附近蛋白表達量增加導致的。
 

 

 

圖2 lectin blot驗證凝集素芯片結果

 
第4步：關鍵糖蛋白鑒定

 為了進一步明確是哪個蛋白的表達量發(fā)生了上調，研究人員以凝集素SNA-I為釣餌，進行了pull down實驗。血清pull down產物（P-M3）經電泳分離后，對42 kDa分子量附近的蛋白條帶進行了質譜鑒定。結果顯示，高同源性蛋白HP和HPR的鑒定分值Z高。隨后通過western blot驗證，發(fā)現(xiàn)HPR在支原體肺炎組（M組）中表達量明顯上調，如圖3。
 

 

圖3  HPR可能是潛在的肺炎診斷標志物 

第5步：HPR標志物評判

        最后，研究人員應用western blot技術對更多例數(shù)的血清樣品進行檢測。結果顯示：肺炎組的HPR水平要高于健康對照組（p＜0.001），并且與細菌性肺炎組相比，HPR表達水平在非細菌性肺炎組（支原體肺炎組和病毒性肺炎組）更高（p＜0.05），如圖4。表明HPR可以作為潛在的兒童肺炎診斷指標，并且具有針對兒童細菌性肺炎與非細菌性肺炎的鑒別診斷的潛力。
 

 

 

圖4  HPR標志物評判

小科普：揭開凝集素芯片的神秘面紗~
       凝集素（Lectin）是一類自然界廣泛存在的蛋白質，具有識別特定糖結構的特性。利用凝集素進行糖結構的解析是糖相關生物學研究領域的常用手段，迄今發(fā)現(xiàn)超過300種，并且已有近100多種能通過商業(yè)途徑獲得。華盈生物提供的凝集素芯片是將商業(yè)途徑獲得的55種經典凝集素，以微陣列的形式固定在高分子三維芯片片基上，形成高通量凝集素芯片，可進行多種糖結構的同步篩選和交叉驗證。隨著近年來糖組學研究的興起和蓬勃發(fā)展，越來越多的蛋白被證實具有糖基化修飾，同時其在生命活動中的重要性越來越被認可。該芯片的誕生不僅為專注于糖基化相關研究的科研工作者提供了有力的工具，也為廣大其它研究領域的科研工作者提供了新的研究視角和技術手段。

 

凝集素芯片特點：

• 芯片基片：高分子三維基片，75*25 mm

• 凝集素種類：55種

• 點體積：0.5~1 nL/點

• 點重復：3次

• 可檢測樣品：14個

 

凝集素芯片應用:

• 特定蛋白表面糖鏈結構檢測

  Functional glycosylation of human podoplanin: Glycan structure of platelet aggregation-inducing factor. （FEBS Lett.  PMID: 17222411）

• 完整細胞表面糖基化譜檢測

  Lectin RCA-I specifically binds to metastasis-associated cell surface glycans in triple-negative breast cancer.  (Breast Cancer Res.  PMID: 25848723)

• 組織或細胞裂解液糖基化差異篩選

  Molecular imaging using fluorescent lectins permits rapid endoscopic identification of dysplasia in Barrett's esophagus. (Nat Med.  PMID: 22245781)

• 唾液樣本糖基化檢測

  Age- and Sex-Associated Differences in the Glycopatterns of Human Salivary Glycoproteins and Their Roles against Influenza A Virus. (J Proteome Res.  PMID: 23590532)

• 石蠟包埋樣本檢測

  A systems biology approach identifies FUT8 as a driver of melanoma metastasis. (Cancer Cell.  PMID: 28609658)（參見案例解析）