斑馬魚的基因敲除定制（Cas9-KO）法介紹

利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)，針對靶基因序列設(shè)計 sgRNA， 指導 Cas9 蛋白在特定基因位點引起 DNA 雙鏈斷裂，在非同源性末端接合修復(fù)斷裂 DNA 的過程中，靶基因堿基突變或缺失被引入到斑馬魚基因組中，最終導致靶基因無法正常轉(zhuǎn)錄翻譯，達到基因敲除的目的。目前我們利用 CRISPR/Cas9 技術(shù)，提供 TU 品系的基因敲除斑馬魚制備，TU 系是最為普遍使用的標準純遺傳背景品系之一。同時也可根據(jù)委托方的需求，提供 AB 以及其它遺傳背景的基因敲除斑馬魚服務(wù)。 

• 班馬魚基因靶向改造敲除突變體的建立技術(shù)路線
  • 分析目標基因的基因組結(jié)構(gòu)，確定目標基因靶向位置
  • 通過Sanger測序，確認目標基因靶向位置序列信息準確
  • 根據(jù)每個目標基因的靶向突變位置，設(shè)計并體外合成4條不同的sgRNA
  • 制備Cas9 mRNA或蛋白質(zhì)
  • 鑒定所制備的4條sgRNA是否具有在斑馬魚胚胎內(nèi)引導Cas9切割目標基因的活性
  • 將有活性的sgRNA和Cas9 mRNA（或蛋白質(zhì)）共同注射斑馬魚受精卵
  • 待注射胚胎生長至6 hpf后，隨機選取5枚胚胎，確認Founder胚胎細胞攜帶目標基因突變的等位基因
  • 將經(jīng)注射的受精卵飼養(yǎng)至45-60日齡時，通過對尾鰭的基因組鑒定確認Founder（F0）體細胞攜帶目標基因突變的等位基因
  • 獲得F0的后代F1代
  • 至45-60日齡時，通過剪尾鰭的方法進行基因型鑒定，篩選F1個體，獲得基因敲除突變體
• 乙方為甲方提供的最終服務(wù)產(chǎn)品
  • 提供可有效識別  基因的靶向突變位置基因組序列的sgRNA不少于1條
  • 提供攜帶   基因靶向突變的雜合子（當純合突變不致死時，可能是兩個等位因均突變的純合突變子）斑馬魚（不小于1月齡） 3 尾（基因型可不相同）。

2.3上述突變體中，目標基因的突變應(yīng)在外顯子所在區(qū)域，位于起始密碼子后，其突變類型為插入或缺失（Indel）突變，且應(yīng)是移碼突變，導致目標基因編碼序列出現(xiàn)提前的終止密
碼子,預(yù)期編碼一個截短蛋白；或者，突變的位置由客戶指定，經(jīng)乙方認定可行后，實施靶向改造，造成插入或缺失（Indel）突變。
2.4提供上述突變的目標基因等位基因的基因型（附有測序報告）；
2.5提供鑒定上述突變體的鑒定方法；

• 提供階段性項目進展報告
• 提供上述基因靶向突變的斑馬魚突變體建立過程的技術(shù)服務(wù)項目總結(jié)報告。