如何在PCR檢測過程中降低檢測結果假陰性概率

1. 什么是PCR技術？

PCR技術又稱為聚合酶鏈式反應。是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。
在新冠病毒檢測中，核酸檢測被定義為臨床診斷的金標準，RT-PCR技術被反復提到，它是一種將RNA反轉錄與PCR相結合的技術。首先在反轉錄酶的作用下，將提取到的RNA合成cDNA,再以cDNA為模板，在DNA聚合酶作用下不斷擴增（變性-退火-延伸多個循環(huán)）合成目的片段并進行分析。
 

1. PCR用水

PCR技術目前多搭配試劑盒使用，也有用戶自行制備反應體系，無論哪個過程都需要使用水。無論是近年來季節(jié)性爆發(fā)的甲流乙流，還是目前全球都在經歷的新冠病毒，在檢測過程中都涉及一個痛點，那就是如何盡可能提高核酸檢測的準確性，減少假陰性結果出現的可能性。
我們首先分析一下假陰性結果出現的可能性，以新冠病毒核酸檢測為例，假陰性的主要原因有：

• 病人病程：不同病程，患者體內病毒載量不同
• 采樣部位：咽拭子，鼻咽拭子，痰液，肺泡灌洗液等不同采樣部位病毒載量均不同
• 采樣準確性：拭子質量，工作人員操作等
• 試劑盒的質量：引物設計以及水質控制

為了順利將提取到的RNA反轉錄并實現DNA的成功擴增，必須抑制核糖核酸酶（RNases）的降解作用，如果試劑盒用水內含RNases，將極有可能導致假陰性結果的出現。
 

1. 去除RNases的主要方法

• 高壓滅菌：即便是在180℃下高壓滅菌4h之后，RNases仍保持某些活性，且某些特定細菌失活會釋放更多的RNases
• DEPC法（二乙基焦碳酸酯處理法）：利用二乙基焦碳酸酯（DEPC）處理方法使化學酶失活是用來抑制水溶液中RNases活性的常見方法。然而，二乙基焦碳酸酯是一種可疑致癌物，處理須小心；同時該方法雖然能夠使酶永久失活，卻無法將其從水中去除，同時清除多余的DEPC過程中，會產生乙醇，二氧化碳等其他污染物。
• 超濾法：超濾是一種真正能夠從水溶液中清除RNases的方法。默克Milli-Q選用內置在丙烯腈丁苯橡膠（ABS）外殼中的聚砜超過濾膜作為超濾柱的主要成分，在一定水流速一定濃度范圍內，超濾具有充分的截留作用。超濾處理可有效取代DEPC處理方法生產無RNase水。

 
 

1. Milli-Q生產無RNases水解決方案：

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默克Milli-Q® Biopak終端精制器
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