定量方法知多少-絕對定量

在做qPCR實驗時，我們經(jīng)常會問：“你是做絕對定量還是相對定量呢？”，而定量方法的選擇是取決于實驗的目標。絕對定量可測定目標核酸分子的實際拷貝數(shù)，但也是最費力、最復雜的定量形式。此方法要求周密的實驗方案和高度準確的標準曲線，常用于確定病毒滴度。

使用標準曲線進行絕對定量

絕對定量是通過樣品的Cq值和標準曲線進行比較實現(xiàn)的。首先為了建立標準曲線，需要已知拷貝數(shù)濃度的標準品，對標準品進行5次以上的連續(xù)梯度稀釋，將稀釋的標準品進行實時熒光定量PCR擴增，最后根據(jù)各樣品的拷貝數(shù)濃度及相應的Cq值繪制標準曲線，得到線性方程Cq= -klgX0+b，其中X0為起始模板量。然后將未知樣本的Cq值與此標準曲線進行比較，確定其拷貝數(shù)濃度。

從圖1可以發(fā)現(xiàn)，當模板起始濃度越大時，熒光達到閾值的循環(huán)數(shù)越少，即Cq值越小。反之，模板起始濃度越小時，Cq值越大。起始模板量的Log值與循環(huán)數(shù)Cq值呈線性關系，通過已知起始拷貝數(shù)的標準品作出標準曲線，即可確定未知待測樣本中目的基因的量。

如何選擇標準品？

如前所述，生成絕對標準曲線采用的模板將決定數(shù)據(jù)的準確度。所以最好使用與實驗樣本盡可能類似的目標模板，可優(yōu)選有證的標準物質(zhì)或參考物質(zhì)。那么制備標準品的常見方法如下：

☑  DNA 標準品：目的靶點的PCR擴增片段或含有目的靶點的質(zhì)粒克�。▓D2）。

優(yōu)點：易于生成、定量，可在適當?shù)膬Υ鏃l件下維持穩(wěn)定性。

缺點：無法進行qRT-PCR 的逆轉(zhuǎn)錄步驟，大大影響了反應效率。

PCR擴增片段：通過常規(guī)PCR進行目的片段擴增，回收純化PCR擴增片段，可直接作為標準品，相對于質(zhì)粒，PCR擴增片段不是那么穩(wěn)定。

質(zhì)�？寺。簩⒛康钠�段進行PCR擴增，回收目的條帶后連入T載體，再進行質(zhì)粒提取，OD值定量，將質(zhì)粒梯度稀釋作為標準品使用。

☑  RNA 標準品：目的靶點的體外轉(zhuǎn)錄RNA(圖3)

優(yōu)點：結合了RT效率，最大程度地模擬了目的靶點。

缺點：需要耗費時間生成該標準品，因其不穩(wěn)定，難以保持長期準確度。

體外轉(zhuǎn)錄RNA：利用實時熒光定量PCR生成的PCR 產(chǎn)物可利用包含5’ T7啟動子的序列和包含 3’ poly(T) 的逆轉(zhuǎn)錄引物重新擴增。體外轉(zhuǎn)錄反應生成多聚腺苷酸化正義mRNA。純化后可將其準確定量并稀釋，用于生成標準曲線。

Azure  Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)——絕對定量示例

1、實驗方法：

•方法:從組織中提取基因組DNA，以TaqMan探針法進行熒光定量檢測

•試劑:PerfeCTa qPCR ToughMix UNG(QuantaBio)

•標準品:質(zhì)粒標準品濃度為10⁶、10⁵ 、10⁴ 、 10³ 、10²、10¹；3個重復；設陰性空白對照

•實驗步驟:提取gDNA→設計特異引物探針→qPCR擴增→結果分析

2、實驗數(shù)據(jù)：

3、標準曲線：

R^2=1    y= -3.349x+32.87

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