PCR擴增效率的評估-擴增曲線的解讀
做過PCR的小伙伴都知道，PCR前期的驗證引物探針性能和確定最適反應條件是確保正式實驗順利進行的前提。PCR實驗中有個相當重要的工作——即是PCR擴增效率的評估。擴增效率是PCR檢測性能最重要的指標之一，也是定量分析計算結果時所需要的參數(shù)。接下來，讓小編給大家細細說來吧。
什么是擴增效率
PCR是一種DNA體外擴增技術，通常包括了30 - 50個循環(huán)周期。每個循環(huán)中，目標DNA分子的拷貝數(shù)最多會增加1倍。但在實際反應中，1個DNA分子在1個擴增循環(huán)后被成功復制的概率，也就是擴增效率E<1。而PCR的特點是反應初期目標DNA分子呈現(xiàn)指數(shù)增長，這個階段的擴增效率可以無限接近于1；隨后由于反應組分消耗或聚合酶活性下降或兩者共同作用，導致反應效率逐漸下降并最終停止。不管是定量DNA分子初始量，還是計算表達量差異，都需要精確評估PCR擴增效率。
如何評估擴增效率
標準曲線是評估PCR擴增效率最可靠和穩(wěn)定的一種方法，被研究者們廣泛認可。該方法涉及到制作一系列的樣品來控制目標模板的相對數(shù)量。這些樣品通常由濃縮的原液連續(xù)稀釋而成，最常用的是10倍稀釋。使用一系列稀釋樣品，采用標準qPCR程序進行擴增獲得Cq值，最后根據(jù)各樣品濃度及相應的Cq值繪制標準曲線，得到線性方程Cq= -klgX0+b，擴增效率E=10(-1/k)-1。利用qPCR進行定量分析時，要求擴增效率范圍在90%-110%（3.6＞k＞3.1）。
影響擴增效率的關鍵因素
PCR的效率取決于許多因素，包括以下方面：
1）檢測的性能。這取決于引物、模板的序列和結構。二級結構和分子間的相互作用都會降低PCR效率。
2）樣品基質。其中可能含有來自樣品的抑制劑和其他干擾物質，或攜帶來自上游加工步驟的試劑。檢測樣品是否有抑制作用，可使用RNA或DNA Spikes方法進行檢測，或者通過倍比稀釋得到標準曲線也可以觀察到。
3）所用試劑及其濃度。本質上，任何PCR試劑都會一定程度上限制PCR反應速率和性能。
4）競爭性反應。多重反應時，各基因的擴增存在反應成分的競爭。
5）qPCR儀器。由于儀器特定的硬件/軟件屬性和設置、以及用于提取Cq值的特定算法不同，相同的實驗中，不同的儀器會產(chǎn)生不同的PCR效率。
6）技術重復。一般進行3次以上的技術重復以校正實驗誤差，重復數(shù)越多精確度越高。
7）連續(xù)稀釋中的移液體積。移液體積越大，移液器誤差或操作誤差引起的影響越小。
qPCR擴增效率的判斷
qPCR擴增效率主要是通過標準曲線的線性關系方程Cq=-klgX0+b來判斷，擴增效率E在90%-110%之間時，認為擴增接近理想情況；參數(shù)R2要求≥0.98，R2越接近1，則說明Cq和X0的Log值之間的相關性越高。
那么擴增效率E表現(xiàn)不好，主要分為兩種情況：
1）過低的擴增效率（<90％）
可能存在的原因：
☑ 移液器校準不良或移液技術差。
☑ 不正確的稀釋導致標準曲線出現(xiàn)錯誤。
☑ 染料濃度低熒光或者儀器未校準染料。
☑ 引物設計不好或擴增子具有二級結構。
☑ 標準曲線動態(tài)范圍太小。
☑ Taq酶無活性或活性降低。
☑ 樣品抑制。
2）過高的擴增效率（> 110％）
可能存在的原因：
☑ 移液器校準不良或移液技術差。
☑ 不正確的稀釋導致標準曲線出現(xiàn)錯誤。
☑ 引物二聚體或非特異性擴增。
☑ 標準曲線動態(tài)范圍太小。
☑ 基因組DNA污染（僅限RNA模板未進行DNase I處理或DNase I消化不完全）。
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