Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)在檢測單拷貝DNA的應(yīng)用
介紹：
Azure Cielo™ 3和Cielo™ 6 實時熒光定量PCR系統(tǒng)具有卓越的靈敏度。該系統(tǒng)配置新型的高性能光學系統(tǒng)，采用16組光纖單孔掃描設(shè)計，一根光纖用于高能LED激發(fā)，另一根用于光信號檢測，可16孔同時采集(圖1)。特殊的激發(fā)/發(fā)射方式保證單孔掃描時僅激發(fā)一個孔，光纖傳導(dǎo)也有效消除光散射，完全避免孔外區(qū)域的激發(fā)，減少背景噪聲的來源，以便更靈敏的檢測。
同時Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)采用“全孔檢測”技術(shù)，每個孔可采集大約100,000個數(shù)據(jù)點。檢測時取讀數(shù)的平均值，精準測定每個孔的熒光強度。這種“全孔檢測”為每個采集時間點提供了比單孔掃描系統(tǒng)更準確的數(shù)據(jù)，因為單孔掃描系統(tǒng)僅僅采集少量的數(shù)據(jù)點。
如何可靠地檢測低拷貝數(shù)的靶標呢？首先要考慮引物和探針的特異性，這會直接影響qPCR檢測能力的高低，其次考慮靈敏度，即當探針信號高于背景噪聲時儀器檢測的靈敏度。在其他的反應(yīng)成分相同的情況下，更高靈敏度的儀器可以更早的檢測到信號或得到更小的Cq值。為了證明Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)在低拷貝數(shù)的靶標檢測中的靈敏度和重復(fù)性，進行了單拷貝靶標DNA的擴增實驗。
方法：
配制20µl反應(yīng)體系，利用單拷貝DNA為模板進行qPCR擴增。
分別在Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)和競爭產(chǎn)品的系統(tǒng)上運行兩次96孔板。使用每個儀器提供的軟件收集和分析數(shù)據(jù)，以確定每個孔的Cq值。
結(jié)果與討論：
單拷貝DNA擴增結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)中檢測到88個孔(92%)有熒光信號，競爭產(chǎn)品中檢測到77個孔(80%)(圖2A)，結(jié)果表明，Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)提高了單拷貝擴增的檢測概率，這也反映了其檢測靈敏度更高。那么對于單拷貝DNA擴增來說，那些沒有熒光信號的孔可能是靶標DNA沒有進入到孔中，所以沒有檢測到熒光信號。
同時發(fā)現(xiàn)，Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)測量的Cq平均值比競爭產(chǎn)品要早2個循環(huán)(Cq 36.39 vs 38.53)(圖2A)。并且Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)的Cq值SD小于競爭產(chǎn)品的值(0.91 vs 1.16)，這進一步說明了Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)的檢測具有良好的重復(fù)性。
此外，將兩者的擴增曲線進行比較，發(fā)現(xiàn)在競爭產(chǎn)品上某些擴增曲線起峰較晚，擴增曲線起峰位置不一致（圖3B），Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)的擴增曲線起峰位置基本一致（圖3A）。這也說明了Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)高靈敏度的“全孔檢測”技術(shù)和多數(shù)據(jù)點的捕獲方式可以給您帶來真實可靠的擴增結(jié)果。
總的來說，隨著靶標DNA數(shù)量的減少，qPCR的可靠性也會逐漸降低，然而現(xiàn)代應(yīng)用不斷突破這一技術(shù)的極限，對qPCR的性能提出了更高的要求。以上結(jié)果證明了Azure Cielo™實時熒光定量PCR系統(tǒng)具有卓越的靈敏度和可靠性，即使檢測單拷貝DNA分子，仍可獲得具有高度重復(fù)性的定量數(shù)據(jù)。
參考文獻：
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