FITC&AMC等熒光標(biāo)記技術(shù)

     
下表是一些熒光物質(zhì)的激發(fā)光波長(zhǎng)Ex(nm)和發(fā)射光波長(zhǎng)Em(nm):​

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• · FITC修飾
• FITC(異硫氰酸熒光素)具有比較高的活性，我們公司可以通過(guò)兩種方式將FITC標(biāo)記于多肽上：(1) 將FITC標(biāo)記于賴氨酸（Lys）或被選擇性地脫保護(hù)的鳥(niǎo)氨酸（ornithine）側(cè)鏈氨基上；(2) 將FITC標(biāo)記于多肽N端氨基。
• 當(dāng)在N端標(biāo)記時(shí)，建議在最后一個(gè)氨基和由異硫氰酸酯與氨基反應(yīng)產(chǎn)生的硫脲鍵之間引入烷基間隔器（alkyl spacer）如氨基己酸（Ahx）。鏈接切割需要酸性環(huán)境，在N端標(biāo)記FITC的多肽需經(jīng)歷環(huán)化作用來(lái)形成熒光素，通常會(huì)伴有最后一個(gè)氨基酸的去除，但當(dāng)有一個(gè)間隔器如氨基己酸，或者是通過(guò)非酸性環(huán)境將目的肽從樹(shù)脂上切下來(lái)時(shí)，這種情況可避免�？臻g位阻被認(rèn)為是在熒光染料前使用Ahx的主要原因，而不是為什么FITC不能直接偶聯(lián)在多肽上的原因。
• Ahx或b-Ala均可作為間隔器用于FITC標(biāo)記的多肽上。
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• · AMC修飾
•        AMC(7-氨基-4-甲基香豆素)是一種應(yīng)用廣泛的熒光標(biāo)記試劑， 與其他熒光染料不同的是，AMC修飾多肽分子是從C端進(jìn)行：
•      （1）AMC與肽鏈C端第一個(gè)氨基酸反應(yīng);
•      （2）固相合成整條肽鏈（從第二個(gè)氨基酸開(kāi)始），并且保留整條肽鏈的側(cè)鏈保護(hù)基和最后一個(gè)氨基保護(hù)基；
•       （3）液相縮合AA-AMC與全保護(hù)的肽鏈；
•       （4）切除保護(hù)基，完成肽鏈的修飾。
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通常，生物素、FITC等染料可任意標(biāo)記在多肽N端或C端。但我們推薦N端標(biāo)記，其成功率更高、所需時(shí)間更短、更易操作。由于多肽都是從C端往N端合成，所以N端修飾將是固相合成的最后一步，不再需要額外的偶聯(lián)步驟。相反，如果是C端標(biāo)記，則需要附加步驟，而過(guò)程會(huì)更復(fù)雜。
     
大多數(shù)染料都是大型的芳香分子，如此龐大分子的介入有助于避免標(biāo)簽和多肽之間的相互作用。這將有助于保持多肽的構(gòu)象和生物學(xué)活性。一般來(lái)說(shuō)，推薦引入一個(gè)柔性間隔如Ahx(一個(gè)6碳化合物)會(huì)使熒光標(biāo)記更加穩(wěn)定。否則FITC將很容易與其他任何位置的半胱氨酸的巰基或賴氨酸的氨基發(fā)生連接。