單細胞功能蛋白組學(xué)技術(shù)在COVID-19急性后遺癥研究中的應(yīng)用

我們正在面對COVID-19的疫情，隨著疫情繼續(xù)流行，出現(xiàn)了更多關(guān)于COVID-19急性后遺癥（PASC）的病例。美國疾病控制與預(yù)防中心將PASC定義為人們在SARS-CoV-2感染后可能出現(xiàn)4周或更久的、持續(xù)的健康問題。PASC成為一種新的全球性危機。
 

據(jù)估計，約31%-69%的COVID-19患者患有PASC，其癥狀包括記憶喪失、胃腸道（GI）不適和疲勞、嗅覺喪失和呼吸短促。之前的研究表明，PASC也與患者急性疾病的嚴重程度有關(guān)，PASC可能與自身免疫因素有關(guān)。由于PASC的異質(zhì)性和可能與之相關(guān)的各種因素的差異，迫切需要描述其生物學(xué)和免疫學(xué)基礎(chǔ)，以及檢測這些機制在整個感染和恢復(fù)過程中的變化。
 

為了更好地了解PASC，研究人員對309例COVID-19患者從最初診斷到康復(fù)（2-3個月后）進行了研究。并結(jié)合了臨床數(shù)據(jù)和患者報告的癥狀，從最初診斷到早期恢復(fù)進行了深度多組學(xué)、縱向調(diào)查研究，在最初診斷COVID-19時，找到了4個預(yù)測PASC的因素；對癥狀相關(guān)免疫特征的分析顯示，病人可以化分為四種類型，PASC因素之間的免疫關(guān)聯(lián)隨著時間的推移而減少，導(dǎo)致不同的恢復(fù)期免疫狀態(tài)。該研究結(jié)果最近發(fā)表在《Cell》雜志上一篇題為“Multiple Early Factors Anticipate Post-Acute COVID-19 Sequelae.”的文章。研究為理解“PASC”的異質(zhì)性提供了一個框架，為探究導(dǎo)致PASC的生物學(xué)因素提供了豐富的資源，研究有助于監(jiān)測、指導(dǎo)治療和預(yù)防COVID-19急性后遺癥。

單細胞蛋白組技術(shù)表征患者免疫細胞功能

作者對309例COVID-19患者的臨床數(shù)據(jù)結(jié)合電子病例進行研究，并以457位健康人作為對照�；颊弑环譃槿齻�階段：臨床診斷（T1）、急性疾�。�急性、T2）和初始癥狀出現(xiàn)后2-3個月（恢復(fù)期、T3）。通過抽血，輔以鼻拭子和血漿測量，分析自身抗體、COVID特異性抗體、整體血漿蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)譜；從病人的血液樣品中分離了外周血單個核細胞（PBMC），進行了基因和蛋白層面的單細胞多組學(xué)表征（圖1）。
 

圖1：研究實驗設(shè)計

單細胞功能蛋白質(zhì)組學(xué)揭示了不同細胞對持續(xù)炎癥的潛在影響

免疫失調(diào)可能與PASC有關(guān)；而且許多與嚴重急性COVID-19相關(guān)的免疫細胞表型仍在T3時不同程度上富集，并與PASC相關(guān)。根據(jù)病人的免疫學(xué)特征可以將病人分為四組，即Type1組，Type2組，intermediate組和naïve組（圖2）。
 

圖2：T3期病人分組

為了系統(tǒng)研究PASC與T3期病人免疫狀態(tài)的關(guān)系。在四組病人中，IsoPlexis的單細胞蛋白組學(xué)技術(shù)分析不同類型免疫細胞的功能，包括在疾病進展起重要作用的T細胞、單核細胞和NK細胞亞群，探究與恢復(fù)期患者的疾病嚴重程度存在相關(guān)性，證實了T細胞和單核細胞對于持續(xù)炎癥的影響。研究者從PBMC中分離T細胞、單核細胞、NK細胞等亞群。培養(yǎng)并刺激細胞產(chǎn)生細胞因子，使用IsoPlexis獲得性免疫和固有免疫芯片檢測分泌的細胞因子。數(shù)據(jù)直接端到端傳輸?shù)絀soSpeak軟件分析熒光信號，計算細胞因子分泌細胞的數(shù)量、細胞因子的強度水平等，整體評價細胞的多功能強度指數(shù)（PSI），同時也可以給出單細胞水平的細胞因子圖譜信息（圖3）。結(jié)果表明，所有非naïve患者組在T3時表現(xiàn)出CD8+和CD4+T細胞多功能水平升高；與健康對照組相比，所有患者組均表現(xiàn)出較高的單核細胞多功能。這表明，在恢復(fù)期，所有患者組中都有不同程度的持續(xù)的、已啟動的免疫激活。

單細胞水平的功能蛋白質(zhì)組學(xué)能夠提供一種獨特的評估方式，揭示了恢復(fù)期病人T細胞、單核細胞和NK細胞亞群與不同PASC內(nèi)型以及疾病嚴重程度的關(guān)系。
 

圖3：不同組病人特定細胞亞群的多功能性和細胞因子差異

患者T1到T3免疫狀態(tài)-癥狀軌跡的預(yù)測顯示，即使在COVID-19診斷時，這表明患者可能在感染過程的早期傾向于其急性后狀態(tài)（圖2）。這反過來又表明，這些患者分組與T1時存在的某些PASC因素之間可能存在關(guān)系。進行統(tǒng)計學(xué)分析，顯示了PASC因素與細胞多功能、單細胞免疫表型、血漿蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的關(guān)系及其相關(guān)性（圖4）。
 

圖4：不同的PASC因素與多組學(xué)檢測相關(guān)性

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采集后 IsoLight/IsoSpark 全自動分析系統(tǒng)會接著進行基于 ELISA 原理的蛋白檢測，多重蛋白熒光信號通過儀器內(nèi)成像系統(tǒng)收集后自動傳輸至 IsoSpeak 多維生信分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。簡單直觀的分析軟件，不需額外培訓(xùn)的生信分析人員，分析數(shù)據(jù)圖表可以直接應(yīng)用于文章發(fā)表。

參考文獻：

1. Su, Y., et al. “Multiple Early Factors Anticipate Post-Acute COVID-19 Sequelae.” Cell (2022), doi: https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.01.014.