人牙周膜干細胞在相關信號通路下進行循環(huán)機械應力刺激成骨分化

正畸牙齒移動過程中的生物學基礎是牙槽骨重塑。牙槽骨重塑是一個連續(xù)的、復雜的、協(xié)調的生物學過程，涉及成骨細胞介導的骨形成和破骨細胞介導的骨吸收。人牙周膜干細胞（PDLSCs）的機械應力刺激的成骨分化是正畸中張力側牙槽骨重塑的重要組成部分。

之前的研究表明，在循環(huán)機械應力刺激的 PDLSCs 成骨分化過程中，活性氧（ROS）水平升高，并誘導核因子紅細胞2相關因子2（Nrf2）及其下游分子如血紅素加氧酶1（HO-1）和醌NADH脫氫酶1（NQO1）的表達。

Nrf2作為主要的轉錄調節(jié)因子，通過調節(jié)包括HO1和NQO1在內的抗氧化成分的表達和活性，對內源性抗氧化反應和細胞防御具有關鍵作用。許多信號通路對于調節(jié) Nrf2 活性至關重要，例如蛋白激酶 C（PKC）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）和 p38 絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）。

山東大學口腔醫(yī)院口腔正畸科、山東省口腔組織再生重點實驗室和山東省口腔生物材料與組織再生工程實驗室的一項研究旨在通過基于串聯(lián)質量標簽 (TMT) 的液相色譜串聯(lián)質譜 (LC-MS/MS) 分析探索 Nrf2 潛在的循環(huán)機械應力刺激成骨分化的機制，將 Nrf2 激活劑叔丁基對苯二酚（t-BHQ）應用于正畸大鼠，通過免疫組織化學（IHC）染色檢測成骨標志物的表達水平，以證實 Nrf2 可能是改善正畸中牙槽骨重塑的有希望的治療靶點。
 

首先，實驗通過LC-MS/MS 研究了 Nrf2 在循環(huán)機械應力刺激的 PDLSCs 成骨分化中的潛在分子機制，將PDLSCs在10% 和0.5 hz循環(huán)機械應力下處理0和12 h。結果顯示，與對照相比，162個蛋白出現(xiàn)差異表達，其中下調76個，上調86個。這些差異表達的蛋白質參與了生物過程類別中的信號轉導、運輸和免疫系統(tǒng)過程。在差異表達蛋白的KEGG通路富集分析中，PI3K/Akt 信號通路引起了研究人員的注意，因為它在 Nrf2 的激活和易位中起著至關重要的作用，因此選擇PI3K/Akt信號通路在后續(xù)研究中進一步研究。

接下來，為了確認在循環(huán)機械應力刺激的成骨分化過程中 PI3K/Akt 信號通路參與 PDLSC 中 Nrf2的激活，基于 KEGG 通路分析，在研究中應用了 LY294002。循環(huán)機械應力增加了 Akt的磷酸化（p-Akt），而 PI3K 抑制劑 LY294002 抑制了 p-Akt 的水平（圖1 A）。LY294002下調Nrf2的mRNA、細胞質和核蛋白表達水平（圖1 B、C）。

然后測量了PDLSCs 中有或沒有 LY294002 的情況下，循環(huán)機械應力刺激的成骨分化能力。數(shù)據(jù)顯示，LY294002抑制成骨相關標志物（COL1、RUNX2和OPN）的mRNA和蛋白表達水平（圖1 D、E）。并且LY294002使HO1 的mRNA和蛋白表達水平降低。上述結果表明，循環(huán)機械應力刺激的 PDLSCs 成骨細胞分化中，PI3K/Akt 通路與調節(jié)Nrf2 表達有關。
 

圖1 循環(huán)機械應力刺激下的PDLSCs成骨分化過程中，PI3K/Akt信號通路參與Nrf2激活
 

（A）基于蛋白質印跡實驗，PI3K抑制劑LY294002在循環(huán)機械應力下抑制p-Akt水平。（B） LY294002在循環(huán)機械應力下下調PDLSCs中Nrf2 mRNA水平。（C） LY294002降低了循環(huán)機械應力下PDLSCs中Nrf2的細胞質基質和核蛋白表達水平。 （D） LY294002抑制了循環(huán)機械應力下PDLSCs中成骨相對標記物（COL1、RUNX2、OPN）和HO1的mRNA水平。（E）LY294002抑制了循環(huán)機械應力下PDLSCs中成骨相對標記物（COL1、RUNX2、OPN）和HO1的蛋白質表達水平。（F）Co-IP實驗表明，PDLSCs中Akt和Nrf2之間的蛋白質-蛋白質相互作用分別與抗Akt抗體和抗Nrf2抗體進行免疫沉淀以富集蛋白質復合物。

為了進一步證實在循環(huán)機械應力過程中，PI3K/Akt 信號通路在 PDLSCs 中 Nrf2 激活的參與，在隨后的研究中使用了 STRING 數(shù)據(jù)庫。結果發(fā)現(xiàn)，Akt 和 Nrf2 之間潛在的蛋白質-蛋白質相互作用可能與該過程有關。用抗 Nrf2 抗體進行免疫沉淀實驗以富集含有 Nrf2 的蛋白質復合物，然后用抗 Akt 抗體進行蛋白質印跡。結果表明，Akt存在于含有Nrf2的復合物中（圖1 F）。這些數(shù)據(jù)進一步表明，在循環(huán)機械應力刺激的成骨分化過程中，PI3K/Akt 信號通路參與了 PDLSCs 中 Nrf2 的激活。

其次，在基于 TMT 的 LC-MS/MS 分析的差異表達蛋白質中，HO1 和 SOD2（Nrf2 的下游抗氧化因子）之間潛在的蛋白質-蛋白質相互作用可能與循環(huán)機械應力誘導的成骨細胞分化有關。之前的研究表明，循環(huán)機械應力促進了 Nrf2 及其下游抗氧化劑 HO1 的表達。以下研究中評估了 PDLSCs 中 SOD2 的表達。數(shù)據(jù)顯示，SOD2 的 mRNA 和蛋白表達在循環(huán)機械應力過程中上調（圖2 A-C）。這些數(shù)據(jù)表明，PDLSCs中HO1和SOD2之間的潛在相互作用可能與循環(huán)機械應力刺激的成骨細胞分化有關。

為了進一步證實在循環(huán)機械應力過程中HO1和SOD2的相互作用參與PDLSCs，進行了Co-IP實驗。用抗 HO1 抗體進行免疫沉淀實驗以富集含有 HO1 的蛋白質復合物，然后用抗 SOD2 抗體進行蛋白質印跡，數(shù)據(jù)顯示 SOD2 存在于含有 HO1 的復合物中。根據(jù) Co-IP 實驗的結果（圖2 D），證實了HO1和SOD2之間的相互作用與循環(huán)機械應力刺激的成骨分化有關。
 

圖2 循環(huán)機械應力刺激下 PDLSCs 中HO1 和 SOD2的蛋白質-蛋白質相互作用。
 

（A）循環(huán)機械應力期間PDLSCs中SOD2的免疫熒光染色。（B）根據(jù)RT-PCR的結果，循環(huán)機械應力上調PDLSCs中SOD2 mRNA的表達。（C）根據(jù)蛋白質印跡的結果，循環(huán)機械應力促進了SOD2蛋白在PDLSCs中的表達。（D）Co-IP實驗表明，PDLSCs中HO1和SOD2之間的蛋白質-蛋白質相互作用分別作為抗HO1抗體和抗SOD2抗體的免疫沉淀來富集蛋白質復合物。

之前的研究表明，Nrf2 對循環(huán)機械應力刺激的成骨細胞分化具有積極作用。最后為了驗證 Nrf2 可能是正畸治療中一個有前途的治療靶點，實驗將 t-BHQ、Nrf2 激活劑和 FDA 批準的食品添加劑應用于正畸大鼠，通過IHC染色檢測PDL中成骨相關標志物的表達水平。結果表明，T-BHQ可促進正畸大鼠張力側PDL中Nrf2及其下游抗氧化劑HO1的表達。t-BHQ 處理正畸大鼠中 ALP 和 COL1（成骨相關標志物）的表達水平上調。這些結果表明，Nrf2 可能是有希望的治療干預靶點，對正畸中的牙槽骨重塑具有積極作用。

總之，Nrf2 激活通過 PI3K/Akt 通路和 HO1-SOD2 相互作用參與 PDLSCs 中循環(huán)機械應力刺激的成骨分化。Nrf2 激活劑 T-BHQ 增強了正畸大鼠張力側成骨標志物的表達水平。Nrf2可能是改善正畸治療中牙槽骨重塑的潛在且有希望的治療靶點。

參考文獻：Xi X, Li Z, Liu H, Chen S, Liu D. Nrf2 Activation Is Involved in Cyclic Mechanical Stress-Stimulated Osteogenic Differentiation in Periodontal Ligament Stem Cells via PI3K/Akt Signaling and HO1-SOD2 Interaction. Front Cell Dev Biol. 2022 Jan 6;9:816000. doi: 10.3389/fcell.2021.816000. PMID: 35071244; PMCID: PMC8770743.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35071244/

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