DNMT3A突變小鼠模型助力揭示衰老相關(guān)克隆性造血分子的機制

克隆性造血屬于血液腫瘤的癌前病變狀態(tài)，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，克隆性造血會隨著個體的衰老而不斷加劇，因而也被稱為衰老相關(guān)克隆性造血。克隆性造血的個體發(fā)生白血病的風(fēng)險較正常人增加了10倍，并出現(xiàn)髓系細胞分化偏向性，從而導(dǎo)致系統(tǒng)性慢性炎癥，進而使得炎癥相關(guān)疾病如動脈粥樣硬化、心肌梗死以及中風(fēng)的發(fā)生率提高了約1倍^[1-3]。而全身性的慢性炎癥反過來加劇克隆性造血的進展，從而形成一個惡性循環(huán)（圖1）。

克隆性造血發(fā)生率隨著年齡增大而增加，并伴隨著很多關(guān)鍵基因的突變，其中DNMT3A在多個研究中都顯示為突變頻率最高的基因^[4]。DNMT3A可測到的突變位點多達190個，其中R882位點突變在克隆性造血個體中占17%，在急性髓系白血病（AML）個體中占比高達50%^[5]。由于克隆性造血為白血病的癌前病變狀態(tài)，由此說明攜帶R882突變的克隆性造血患者更容易轉(zhuǎn)化為白血病^[6,7]。那么，DNMT3A突變頻率隨著衰老不斷增加的分子機制尚不明確。
 

研究材料
在這項研究中，研究人員使用了Dnmt3a^fl-R878H/+小鼠（由賽業(yè)生物提供）、Vav-iCre小鼠、Mlkl^-/-小鼠、Ripk1^K45A小鼠、Ripk3^Δ/Δ小鼠、CD45.1小鼠以及CD45.1/2小鼠。

技術(shù)方法
本項研究主要采用了流式分析、流式分選、全骨髓競爭移植、LPS炎癥模型、體外培養(yǎng)造血干及祖細胞、細胞因子芯片檢測、蛋白質(zhì)印跡以及實時定量PCR研究方法。

技術(shù)路線
 

 

研究結(jié)果

1.衰老的骨髓促進DNMT3A R878H驅(qū)動的克隆性造血
研究者從年輕的R878H小鼠（即Dnmt3a^fl-R878H/+, Vav-icre⁺，其中Dnmt3a^fl-R878H/+小鼠由賽業(yè)生物提供，通過ES打靶技術(shù)構(gòu)建）中提取骨髓細胞，連同正常的競爭者骨髓細胞移植到年輕與年老的受體小鼠中。結(jié)果顯示，R878H骨髓細胞在年老受體小鼠中重建率更高，而WT細胞則沒有明顯差異（圖2），說明年老的骨髓微環(huán)境促進了R878H誘導(dǎo)的克隆性造血。那么到底是年老骨髓中什么因素促進了R878H細胞的克隆性擴增呢？
 

2.LPS誘導(dǎo)的慢性炎癥促進R878H驅(qū)動的克隆性造血
近些年來，普遍認為衰老與炎癥密切相關(guān)，因此有了炎性衰老（Inflamm-aging）的概念。那么，R878H細胞在年老骨髓中的克隆性擴增是否與年老的骨髓炎癥微環(huán)境增強相關(guān)呢？為此，研究者分別用LPS模擬急性和慢性炎癥刺激。發(fā)現(xiàn)R878H HSC對于急性炎癥刺激的響應(yīng)明顯下降，而慢性炎癥刺激可以促進R878H細胞驅(qū)動的克隆性造血（圖3）。
 

圖3 LPS誘導(dǎo)的慢性炎癥促進R878H驅(qū)動的克隆性造血

3.R878H HSC抵抗TNFα誘導(dǎo)的細胞損傷
研究者分別取年輕和年老受體小鼠的骨髓上清做細胞因子芯片分析，發(fā)現(xiàn)其中TNFα信號通路在年老骨髓中顯著上調(diào)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，R878H HSC可以抵抗TNFα誘導(dǎo)的細胞損傷（圖4），證明TNFα是年老骨髓微環(huán)境中促進R878H細胞克隆性擴增的主要炎癥因子。
 

圖4 R878H HSC抵抗TNFα誘導(dǎo)的細胞損傷

4.Dnmt3a R878H細胞抵抗細胞程序性壞死激活
研究者將年老受體骨髓中的LSK細胞分選出來做RT-PCR，分別檢測TNFα信號下游相關(guān)的通路基因的表達，發(fā)現(xiàn)凋亡通路的Fadd和Caspase-8以及細胞程序性壞死通路的Ripk1和Ripk3表達下降（圖5），說明凋亡和程序性壞死通路在R878H細胞中受到了抑制。進一步研究發(fā)現(xiàn)，R878H細胞能夠部分抵抗細胞程序性壞死，而不是凋亡（圖5），說明Dnmt3a R878H細胞通過抵抗細胞程序性壞死的激活而獲得增殖優(yōu)勢。

研究結(jié)論
在這項研究中，研究者利用造血干細胞競爭性移植和LPS誘導(dǎo)的炎癥模型來檢測炎癥和衰老微環(huán)境對DNMT3A R878H驅(qū)動的克隆性造血的作用，觀察到R878H骨髓細胞在衰老的骨髓微環(huán)境和炎癥侵襲時表現(xiàn)出增強的重建能力，發(fā)現(xiàn)R878H造血干及祖細胞通過抵抗由TNFα誘導(dǎo)、RIPK1–RIPK3–MLKL介導(dǎo)的細胞程序性壞死而促進R878H驅(qū)動的克隆性造血，而衰老上調(diào)的炎癥信號（主要為TNFα信號）可以加速這一過程（圖6）。

該研究系統(tǒng)性地從DNMT3A R878H小鼠模型的構(gòu)建，到DNMT3A R882突變引發(fā)衰老相關(guān)克隆性造血的機制研究，解析了衰老進程中DNMT3A hR882H/mR878H突變導(dǎo)致造血干細胞克隆性增生的分子生物學(xué)機制，對DNMT3A突變及其他相關(guān)突變驅(qū)動的克隆性造血及白血病研究具有一定的指導(dǎo)意義。
 

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參考文獻：

[1]Genovese G, Kähler A K, Handsaker R E, et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence[J]. N Engl J Med, 2014, 371(26): 2477-2487.

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[3]Jaiswal S, Natarajan P, Silver A J, et al. Clonal Hematopoiesis and Risk of Atherosclerotic Cardiovascular Disease[J]. N Engl J Med, 2017, 377(2): 111-121.

[4]Bick A G, Weinstock J S, Nandakumar S K, et al. Inherited causes of clonal haematopoiesis in 97,691 whole genomes[J]. Nature, 2020, 586(7831): 763-768.

[5]Brunetti L, Gundry M C, Goodell M A. DNMT3A in Leukemia[J]. Cold Spring Harb Perspect Med, 2017, 7(2).

[6]Miles L A, Bowman R L, Merlinsky T R, et al. Single-cell mutation analysis of clonal evolution in myeloid malignancies[J]. Nature, 2020, 587(7834): 477-482.

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原文檢索：

MinLiao, RuiqingChen, YangYang, et al. Aging-elevated inflammation promotes DNMT3A R878H-driven clonal hematopoiesis. Acta Pharmaceutica Sinica B. Volume 12, Issue 2, February 2022, Pages 678-691.https://doi.org/10.1016/j.apsb.2021.09.015