Cell創(chuàng)新發(fā)現(xiàn)：非編碼vtRNA可通過(guò)抑制P62寡聚化影響細(xì)胞自噬

自噬是一種細(xì)胞內(nèi)的重要途徑，用于識(shí)別，去除和降解自噬小體內(nèi)的胞內(nèi)成分，細(xì)胞器以及病原體。自從被評(píng)為國(guó)自然重點(diǎn)以來(lái)，自噬的熱度一直居高不下。小優(yōu)回顧了一下之前發(fā)的幾篇自噬相關(guān)的文章，都有較高的閱讀量。

LC3：隱秘的自噬標(biāo)記物！
Nature:自噬促進(jìn)胰腺癌免疫逃逸的機(jī)制
自噬與神經(jīng)退行性疾病的關(guān)系一文帶你吃透，不點(diǎn)進(jìn)來(lái)看看？

非編碼RNA也是今年的國(guó)自然熱點(diǎn)，是指一類不參與編碼蛋白質(zhì)的RNA，但具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)功能的特性，主要包括microRNA，siRNA，lncRNA，vtRNA等等。在最近幾年，非編碼RNA文章數(shù)也增長(zhǎng)迅速。

近十年P(guān)ubMed非編碼RNA相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)

今天小優(yōu)就從Cell期刊中為大家撈出了一篇關(guān)于自噬和非編碼RNA的精品高分文章。這篇文章來(lái)自德國(guó)海德堡的Matthias W. Hentze教授在Cell發(fā)表研究：The Small Non-coding Vault RNA1-1 Acts as a Riboregulator of Autophagy，希望能給大家提供更多的思路。

文章概述：
本文表明了vault RNA直接結(jié)合自噬受體sequestosome-1/p62。過(guò)表達(dá)vtRNA1-1抑制p62依賴的自噬。細(xì)胞饑餓會(huì)降低vtRNA1-1和P62的結(jié)合，從而誘導(dǎo)自噬。P62不能結(jié)合vtRNA的突變會(huì)增加P62的寡聚化，并增加和自噬效應(yīng)物的關(guān)系。因此，vtRNA1-1可以通過(guò)集合P62和干擾寡聚化，從而直接調(diào)節(jié)自噬。

文章亮點(diǎn)：

文章首次發(fā)現(xiàn)并研究了P62和RNA的相互作用。該研究首次將自噬相關(guān)蛋白P62定性為RNA結(jié)合蛋白，并發(fā)現(xiàn)vtRNA可通過(guò)抑制P62的寡聚化，從而影響細(xì)胞自噬。

接下來(lái)小優(yōu)就帶大家具體來(lái)解析下這篇文章，看看作者的研究思路和實(shí)驗(yàn)方法。

1、自噬受體p62/SQSTM1是RNA結(jié)合蛋白
故事開(kāi)始于作者使用了RBDmap技術(shù)鑒定RNA結(jié)合蛋白中與RNA相互作用的肽段。在結(jié)果中發(fā)現(xiàn)有一個(gè)肽段來(lái)自于自噬受體p62/sequestosome-1，表明P62與RNA相互作用。考慮到哺乳動(dòng)物的自噬受體和RNA的相互作用還沒(méi)有人研究過(guò)，作者決定繼續(xù)研究。

作者使用WB和Co-IP技術(shù)進(jìn)一步鑒定p62和RNA之間的關(guān)系。WB和Co-IP結(jié)果均顯示p62是一個(gè)RNA結(jié)合蛋白（Fig.1A and 1B）。然后作者用iCLIP技術(shù)確定是哪種RNA和p62結(jié)合。結(jié)果表明，有四種vault RNA和p62結(jié)合緊密。更多分析表明，p62優(yōu)先結(jié)合在vtRNA的中心結(jié)構(gòu)域的環(huán)狀區(qū)域（Fig. 1C,1D and 1E）。

綜上，結(jié)果顯示，p62和vtRNA的中心結(jié)構(gòu)域有相互作用。

Fig.1 自噬受體p62是RNA結(jié)合蛋白

部分相關(guān)產(chǎn)品

貨號(hào)	名稱	用途
88588	SQSTM1/p62(D5L7G) Mouse mAb	抗體
3449	TDP43(A260) Antibody	抗體
10600023	PVDF 0.45UM 300MMx4M 1/PK	PVDF轉(zhuǎn)印膜
10600002	PT 0.45UM 300MMx4M 1/PK	NC轉(zhuǎn)印膜
abs955	免疫(共)沉淀(IP/CoIP)試劑盒	Co-IP試劑盒
17127901	RPROTEIN A SEPHAROSE FF	ProteinA瓊脂糖
17061801	PROTEIN G SEPHAROSE 4 FF	ProteinG瓊脂糖
SH20022	DMEM高糖培養(yǎng)基	培養(yǎng)基
SH30809	RPMI 1640培養(yǎng)基	培養(yǎng)基
SH30406.05	新西蘭胎牛血清	血清

2、Vault RNA 1-1是P62主要結(jié)合的RNA
作者進(jìn)一步驗(yàn)證vtRNA和p62的相互作用。作者使用了p62 RIP-qPCR技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。作者發(fā)現(xiàn)vtRNA1-1是p62主要結(jié)合的RNA（Fig. 2A）。作者在多個(gè)細(xì)胞系進(jìn)行驗(yàn)證（Fig. 2B and 2C）。

接著作者用純化的蛋白和放射性標(biāo)記的RNA進(jìn)行EMSA實(shí)驗(yàn)。作者在構(gòu)建p62的質(zhì)粒的時(shí)候在N端加上了MBP標(biāo)簽，然后用MBP的填料進(jìn)行純化。結(jié)果表明MBP-62和vtRNA1-1形成復(fù)合物。

為了驗(yàn)證MBP-p62和vtRNA1-1的相互作用是否是特異性的，作者使用非標(biāo)記的tRNA作為特異性的競(jìng)爭(zhēng)者，IRE或者細(xì)菌tRNA作為非特異性的競(jìng)爭(zhēng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，非標(biāo)記的tRNA可以有效的和標(biāo)記的vtRNA競(jìng)爭(zhēng)，而IRE或者細(xì)菌tRNA不能競(jìng)爭(zhēng)（Fig.2D）。

綜上，p62在體外可以特異性的結(jié)合vtRNA1-1。

Fig.2 P62結(jié)合Vault RNA1-1

部分相關(guān)產(chǎn)品

貨號(hào)	名稱	用途
abs60093	Multiplex Probe One Step qRT-PCR Kit	qRT-PCR試劑盒
28918780	MBPTrap	蛋白純化柱
28935597	Dextrin Sepharose High Performance	蛋白純化填料
29148721	Superdex 75 Increase 10/300	蛋白純化柱
28990944	Superdex 200 increase 10/300	蛋白純化柱

3、vtRNA1-1抑制p62介導(dǎo)的自噬
接下來(lái)作者想要繼續(xù)研究vtRNA1-1和p62相互作用的意義。首先作者驗(yàn)證p62會(huì)不會(huì)介導(dǎo)vtRNA的溶酶體降解。結(jié)果表明，無(wú)論是在p62干擾或者敲除的細(xì)胞中，vtRNA的表達(dá)水平都沒(méi)有影響（Fig 2F and 2G）。

接下來(lái)作者進(jìn)行反向研究，看看vtRNA1-1會(huì)不會(huì)影響p62在自噬中的功能。作者在細(xì)胞中敲低 vtRNA1-1，監(jiān)測(cè)自噬流通過(guò)檢測(cè)兩個(gè)參數(shù)，LC3B-1到LC3B-II在自噬體組裝中的轉(zhuǎn)換，以及p62的水平反映自噬溶酶體降解。結(jié)果表明，vtRNA1-1敲低會(huì)刺激LC3B的轉(zhuǎn)換（Fig. 3A and 3B），表明自噬流的增加。為了驗(yàn)證這個(gè)現(xiàn)象是否依賴于p62，作者同時(shí)去除了p62和vtRNA1-1。作者發(fā)現(xiàn)，去除P62會(huì)部分減緩LC3B的轉(zhuǎn)換速率在vtRNA1-1敲除之后（Fig. 3C）。免疫熒光實(shí)驗(yàn)也顯示，vtRNA1-1的去除表現(xiàn)為L(zhǎng)C3B數(shù)量增加（Fig. 3D and 3E）。

作者也檢測(cè)了vtRNA1-1表達(dá)增加會(huì)發(fā)生什么。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，vtRNA1-1表達(dá)增加會(huì)抑制LC3B的轉(zhuǎn)換，并且會(huì)引起p62的積累（Fig. 3G），表明自噬流的下降。相對(duì)的，其他vtRNA的過(guò)表達(dá)不會(huì)影響LC3B的轉(zhuǎn)換速率。

綜上，vtRNA1-1表達(dá)上調(diào)和下調(diào)都會(huì)影響p62依賴的自噬。

Fig.3 vtRNA調(diào)節(jié)P62依賴的自噬

部分相關(guān)產(chǎn)品

貨號(hào)	名稱	用途
101000046	jetPRIME	轉(zhuǎn)染試劑
2775	LC3B Antibody	抗體
4408	Anti-mouse IgG(H+L),F(ab')2 Fragment(Alexa Fluor 488 Conjugate)	熒光抗體
4413	Anti-rabbit IgG(H+L),F(ab')2 Fragment(Alexa Fluor 555 Conjugate)	熒光抗體

4、p62結(jié)合vtRNA1-1主要通過(guò)鋅指結(jié)構(gòu)域

為了研究vtRNA1-1抑制p62功能的機(jī)制，作者決定構(gòu)建一些p62的突變體。P62有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，每個(gè)結(jié)構(gòu)域都有對(duì)應(yīng)的功能，但是沒(méi)有傳統(tǒng)的RNA結(jié)合的區(qū)域（Fig. 5A）。為了鑒定p62的RNA結(jié)合區(qū)域，作者使用RBDmap數(shù)據(jù)并且檢查了在ZZ結(jié)構(gòu)域中RBDpep附近的區(qū)域（Fig. 5A and 5B）。作者從HuH-7細(xì)胞中敲低內(nèi)源的p62，然后將一些p62變體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。結(jié)果表明，p62 K141A變體展現(xiàn)了很強(qiáng)的降低RNA結(jié)合的作用(Fig. 5C)。

接著，作者用P62 KO細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證。作者使用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了HuH-7 P62 KO的細(xì)胞株。然后轉(zhuǎn)染一個(gè)三突變體，R21A，D69A和D73A。p62 PB1m也同樣會(huì)降低RNA的結(jié)合（Fig. 5D）。

綜上，p62主要通過(guò)鋅指結(jié)構(gòu)域結(jié)合vtRNA1-1。

Fig. 5 P62結(jié)合vtRNA1-1主要通過(guò)鋅指結(jié)構(gòu)域

5、vtRNA調(diào)節(jié)p62和Atg8蛋白家族的相互作用

作者進(jìn)一步對(duì)下游機(jī)制進(jìn)行研究。首先作者驗(yàn)證是否RNA的結(jié)合會(huì)影響p62和Atg8蛋白家族的LC3B和GABARAP的相互作用。通過(guò)Co-IP實(shí)驗(yàn)，作者發(fā)現(xiàn)敲低vtRNA1-1，P62和LC3B的相互作用降低（Fig. 6A）。同樣的現(xiàn)象也表現(xiàn)在vtRNA1-1 KO的HuH-7細(xì)胞中(Fig. 6B)。

作者進(jìn)一步使用p62 KO的HuH-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染p62 WT，PK/A和PB1m質(zhì)粒。結(jié)果表明，p62 RK/A表現(xiàn)出和GABARAB更強(qiáng)的相互作用（Fig. 6C and 6D）。而p62 PB1m展現(xiàn)出對(duì)LC3，GABARAP和NBR1較低的結(jié)合（Fig. 6C and 6D）。

綜上，去除vault RNA1-1或者使P62 RNA結(jié)合缺失都會(huì)增加P62和LC3B和GABARAP的結(jié)合，這些數(shù)據(jù)表明vault RNA1-1的結(jié)合影響P62和Atg8蛋白家族的相互作用。

Fig. 6 vtRNA1-1影響P62和Atg8蛋白家族的相互作用

部分相關(guān)產(chǎn)品

貨號(hào)	名稱	用途
13733	GABARAP(E1J4E) Rabbit mAb	抗體
abs153912	Rabbit anti-NBR1 Polyclonal Antibody	抗體

總結(jié)
在這篇文章里，作者使用了多種方法研究vtRNA和P62的相互作用以及對(duì)自噬的影響，例如Co-IP，iCLP，RIP-qPCR，EMSA，CRISPR/Cas9，蛋白純化等等。具體的實(shí)驗(yàn)方法在文獻(xiàn)中都有詳細(xì)介紹。今天想為大家重點(diǎn)介紹一下蛋白純化的方法。

為了更加方便的改造蛋白或者更加便宜和便捷的大量得到某種目標(biāo)蛋白，現(xiàn)在越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室都在選擇蛋白純化的方法進(jìn)行蛋白的純化和改造。蛋白純化的步驟主要分為：質(zhì)粒構(gòu)建——蛋白表達(dá)——蛋白純化，可以選擇使用原核或者真核生物作為表達(dá)體系。具體的操作方法和視頻，大家可以點(diǎn)擊查看原核標(biāo)簽蛋白純化解決方案，里面有詳細(xì)的操作步驟和視頻提供給大家，千萬(wàn)不要錯(cuò)過(guò)哦！

像文章中純化P62時(shí)加上的MBP和His標(biāo)簽也是蛋白純化常用的標(biāo)簽。首先作者構(gòu)建了MBP-p62-his質(zhì)粒，然后在 E.coli BL21(DE3)大腸桿菌表達(dá)體系中進(jìn)行表達(dá)。在37℃培養(yǎng)了6小時(shí)之后，細(xì)胞恢復(fù)到室溫，然后在20℃繼續(xù)培養(yǎng)16H。細(xì)胞加入裂解液 (50mM HEPES pH 8.0, 1M NaCl, 0.5 mM TCEP, 1x protease inhibitor)，并且使用超聲進(jìn)行裂解。然后用His標(biāo)簽預(yù)裝柱和MBP標(biāo)簽預(yù)裝柱進(jìn)行純化。

常見(jiàn)的純化標(biāo)簽及區(qū)別