QCM技術(shù)在病毒-宿主（細(xì)胞）相互作用研究方面的應(yīng)用

一、QCM方法：

石英晶體微天平（Quartz Crystal Microbalance，QCM）是一種非常靈敏的質(zhì)量檢測(cè)方法，其測(cè)量精度可達(dá)納克級(jí)別，比靈敏度在微克級(jí)的電子微天平高100 倍，理論上可以測(cè)到的質(zhì)量變化相當(dāng)于單分子層或原子層的幾分之一。石英晶體微天平利用了石英晶體諧振器的壓電特性，將石英晶振電極表面質(zhì)量變化轉(zhuǎn)化為石英晶體振蕩電路輸出電信號(hào)的頻率變化，進(jìn)而通過(guò)計(jì)算機(jī)等其他輔助設(shè)備獲得高精度的數(shù)據(jù)。

利用QCM技術(shù)，可以通過(guò)石英諧振器頻率的變化感知芯片表面質(zhì)量的變化，生成感應(yīng)曲線，其敏感度可達(dá)到分子水平。實(shí)驗(yàn)時(shí)，只需將細(xì)胞、抗原或抗體等包被于芯片表面，將含有與之互作分子的溶液流過(guò)芯片表面，石英諧振器即可檢測(cè)分子間結(jié)合﹑解離等整個(gè)變化過(guò)程，生成一張傳感圖，提供動(dòng)力學(xué)親和力等數(shù)據(jù)分析。

二、病毒與宿主研究方向的應(yīng)用：

1、病毒侵染細(xì)胞

《四聚體氨基酸基序特性在蛋白酶活化病毒載體功能研究中的作用》

T. M. Robinson, J. Judd, M. L. Ho. Role of Tetra Amino Acid Motif Properties on the Function of

Protease-Activatable Viral Vectors[J]. ACS Biomater Sci Eng. 2016 Nov; 2(11): 2026-2033.

四聚體氨基酸在 蛋白酶活化型病毒（PAVs） 表面形成“肽鎖”結(jié)構(gòu)，其作用是，在沒(méi)有蛋白酶存在的情況下，“肽鎖”鎖定，病毒不能與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合； 在MMP（基質(zhì)金屬蛋白酶）存在的情況下，“肽鎖”的四聚體基序被酶破壞，PAVs可定位于病理學(xué)位點(diǎn)區(qū)域的目標(biāo)細(xì)胞（該區(qū)域細(xì)胞具有升高的胞外蛋白酶特征），與細(xì)胞結(jié)合，將遺傳物質(zhì)核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，而將蛋白質(zhì)衣殼留在胞外（細(xì)胞膜上）。

研究者通過(guò)改變四聚體基序的特性，研究PAVs病毒載體與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合之間的關(guān)系，及其可能的機(jī)制。

在研究過(guò)程中，可以考慮采用以QCM技術(shù)為原理的儀器直接檢測(cè)病毒與細(xì)胞表面受體結(jié)合并導(dǎo)入核酸后在胞外（膜上）留下蛋白質(zhì)衣殼的過(guò)程，與常規(guī)的Western Blotting（蛋白免疫印跡法）和 銀染法相比，QCM技術(shù)具有更加簡(jiǎn)便快捷和直觀的優(yōu)點(diǎn)。

2、與病毒誘導(dǎo)相關(guān)的細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物

《抑制Tip60可降低卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒（KSHV)的裂解及其潛伏基因的表達(dá)并降低KSHV感染型腫瘤細(xì)胞的增殖》

Sydney Simpson, Guillaume Fiches, Maxime J. Jean. Inhibition of Tip60 Reduces Lytic and Latent Gene Expression of Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpes Virus (KSHV) and Proliferation of KSHV-Infected Tumor Cells[J]. Front. Microbiol. 2018 Apr; 9:788.

卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒（KSHV）是一種致瘤性病毒。對(duì)于免疫功能缺陷的個(gè)體，KSHV可誘發(fā)卡波氏肉瘤、原發(fā)型滲出性淋巴瘤（PEL）以及多中心型卡斯特曼病。

Tip60（一種組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，HAT）在此前的研究中已顯示出和KSHV潛伏期相關(guān)核抗原蛋白（LANA, 維持病毒潛伏狀態(tài)的主要因子）以及 ORF36（在裂解期表達(dá)的病毒激酶）具有相互作用。

研究者進(jìn)一步調(diào)查了Tip60-病毒相互作用的關(guān)系，以確定Tip60在病毒生命周期中的作用及其作為未來(lái)靶點(diǎn)治療的潛力。

通過(guò)在攜帶 含KSHV病毒附加體Bac36的質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞中調(diào)節(jié)Tip60表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Tip60對(duì)裂解復(fù)制以及潛在基因的有效表達(dá)都是至關(guān)重要的。Tip60的小分子抑制劑MG149和NU9056可類(lèi)似地抑制潛伏和裂解基因，并且在野生型KSHV+/EBV-PEL，BCBL-1細(xì)胞中減少病毒產(chǎn)生。

在研究過(guò)程中，為了檢測(cè)藥物處理后細(xì)胞中Tip60以及相關(guān)蛋白的表達(dá)量，可以在對(duì)細(xì)胞收獲并裂解處理后，使用包被了相應(yīng)蛋白抗體的芯片、在利用QCM方法學(xué)的儀器上進(jìn)行檢測(cè)，使實(shí)驗(yàn)過(guò)程更加簡(jiǎn)便快捷。

3、抗原-抗體相互作用

《通過(guò)在平板表面固定綴合環(huán)肽以有效模擬HCV病毒包膜E2蛋白 作為 合成疫苗的策略》

Meuleman TJ, Dunlop JI, Owsianka AM. Immobilization by Surface Conjugation of Cyclic Peptides for Effective Mimicry of the HCV-Envelope E2 Protein as a Strategy toward Synthetic Vaccines[J]. Bioconjug Chem. 2018 Apr; 29(4):1091-1101.

使用基于肽的調(diào)節(jié)劑（即，抗原表位模擬物）對(duì)抗體-抗原相互作用的結(jié)合界面進(jìn)行模仿，具有應(yīng)用于疫苗設(shè)計(jì)的前景。

研究者采用配備了硫醇部分、可以用于支持環(huán)狀或線性多肽的柔性TEG接頭合成官能化的溴化物衍生物，環(huán)狀和線性表位模擬物通過(guò)馬來(lái)酰亞胺活化的平板表面上的游離硫醇部分共價(jià)綴合。

對(duì)具有共價(jià)、均一、定向包被表面的環(huán)狀或線性表位模擬物進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，用以探究肽環(huán)化過(guò)程對(duì)于模擬的HCV E2糖蛋白抗體-抗原相互作用的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果首次清楚地闡明環(huán)化肽優(yōu)于線性肽的性能，且環(huán)狀表位模擬物，而非線性表位模擬物，分別顯示出對(duì)其單克隆抗體HC84.1和V3.2的特異性。

上述用于構(gòu)建表位模擬物的策略通過(guò)簡(jiǎn)單地改變合成肽內(nèi)的氨基酸序列顯示出其對(duì)于高通量篩選關(guān)鍵結(jié)合殘基的潛力。據(jù)此，438位的亮氨酸已被鑒定為結(jié)合單克隆抗體V3.2的關(guān)鍵結(jié)合殘基。

在研究過(guò)程中，可以考慮采用以QCM技術(shù)為原理的儀器進(jìn)行環(huán)狀或線性表位模擬物結(jié)合抗體的特異性檢測(cè)。與常規(guī)ELISA實(shí)驗(yàn)相比，QCM技術(shù)可以獲得更多關(guān)于抗體-抗原相互作用的動(dòng)力學(xué)信息以及靶標(biāo)識(shí)別的準(zhǔn)確度信息。

4、病毒誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的體液免疫與細(xì)胞免疫（包括血清中的抗體“垂釣”）

《接種 輔助性T細(xì)胞 CD4位點(diǎn)封閉型 HIV-1 gp140包膜蛋白 疫苗的恒河猴具有強(qiáng)烈且持久的B細(xì)胞及ADCC免疫應(yīng)答特性》

Willy M. J. M. Bogers, Susan W. Barnett, Herman Oostermeijer. Increased, Durable B-Cell and ADCC Responses Associated with T-Helper Cell Responses to HIV-1 Envelope in Macaques Vaccinated with gp140 Occluded at the CD4 Receptor Binding Site[J]. J Virol. 2017 Sep; 91(19).

HIV-1 包膜蛋白gp140或gp120可引發(fā)較弱的B細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，因其持續(xù)時(shí)間較短，需要更好的策略來(lái)提高HIV-1包膜蛋白的免疫原性，以獲得更長(zhǎng)久、更有效的HIV-1疫苗來(lái)誘導(dǎo)B細(xì)胞的免疫應(yīng)答。

研究者假設(shè)病毒包膜蛋白與輔助性T細(xì)胞上的CD4受體結(jié)合導(dǎo)致了T細(xì)胞募集過(guò)程的失效，并因此缺乏強(qiáng)大、穩(wěn)健和持久的記憶B細(xì)胞來(lái)參與以后的免疫應(yīng)答過(guò)程。

為了驗(yàn)證此假設(shè)，研究者通過(guò)采用與3-kDa CD4小蛋白模擬物形成穩(wěn)定交聯(lián)的方法來(lái)封閉gp140的CD4結(jié)合位點(diǎn)，其作用在于阻斷了gp140與CD4⁺輔助性T細(xì)胞的結(jié)合，同時(shí)保持了CD4的可誘導(dǎo)性，使ADCC（抗體依賴(lài)的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用）效應(yīng)器可以把經(jīng)過(guò)中和實(shí)驗(yàn)（滅活）處理的抗原表位作為靶標(biāo)來(lái)啟動(dòng)相應(yīng)的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

研究者發(fā)現(xiàn)，與用gp140直接免疫處理的動(dòng)物相比，接受CD4位點(diǎn)封閉疫苗處理的恒河猴能夠始終表現(xiàn)出優(yōu)越的B細(xì)胞應(yīng)答動(dòng)力學(xué)以及優(yōu)越的ADCC特性。

對(duì)免疫反應(yīng)中的細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在抗原誘導(dǎo)期，CD4位點(diǎn)封閉組的輔助性T細(xì)胞分泌的抗原特異性白細(xì)胞介素4（IL-4）增加得更早（該過(guò)程采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法進(jìn)行檢測(cè)）。

所以，CD4位點(diǎn)封閉型gp140抗原可誘導(dǎo)優(yōu)越的B細(xì)胞和ADCC應(yīng)答，并且被增強(qiáng)的B細(xì)胞應(yīng)答被證明是非常持久的，在免疫作用后可持續(xù)超過(guò)60周。

在研究過(guò)程，QCM方法可以替代 B細(xì)胞酶聯(lián)斑點(diǎn)法實(shí)驗(yàn)、ADCC實(shí)驗(yàn)、T細(xì)胞酶聯(lián)斑點(diǎn)法實(shí)驗(yàn)進(jìn)行多種抗原-抗體、抗體-細(xì)胞、細(xì)胞-細(xì)胞的檢測(cè)（包括對(duì)細(xì)胞因子或特異性抗體進(jìn)行“垂釣”），可獲得關(guān)于免疫應(yīng)答過(guò)程的更詳細(xì)的時(shí)間、強(qiáng)度及動(dòng)力學(xué)特性等數(shù)據(jù)。

       綜上，由于QCM技術(shù)的高靈敏性、檢出過(guò)程無(wú)需對(duì)分子進(jìn)行標(biāo)記、既可以進(jìn)行分子與分子，又可以進(jìn)行細(xì)胞與分子間相互作用的研究，且對(duì)于作用過(guò)程能夠提供詳細(xì)的動(dòng)力學(xué)信息等優(yōu)點(diǎn)，目前已在細(xì)胞表面的動(dòng)力學(xué)反應(yīng)、抗原抗體反應(yīng)、競(jìng)爭(zhēng)力分析、配體垂釣、抗原表位定位等領(lǐng)域廣泛運(yùn)用。在病毒-宿主（細(xì)胞）相互作用方面，可以考慮使用以QCM技術(shù)為原理的儀器替代或補(bǔ)充其他傳統(tǒng)研究手段，進(jìn)一步增強(qiáng)科研能力與效率。

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