高通量3D生物打印在打印角膜基質(zhì)等效品的應用

導讀

人的角膜是眼睛的光學窗口，同時也是眼部藥物傳遞的第一個生理屏障。目前用于治療眼部角膜磨損的藥物配方，其使用的體外動物模型不能準確地在結構和成分方面代表人類角膜，因此需要進行大量的測試，這種動物體外模型測試成本昂貴，而且也無法準確地預測臨床試驗中人類的藥物反應。3D生物打印是一種增材制造技術，細胞被封裝在“生物墨水”中，模擬天然細胞外基質(zhì)（ECM），隨后以逐層方式沉積到指定的幾何形狀，因此，基于體外的3D生物打印在眼部藥物開發(fā)相關中構建角膜模型等方面具有空間精準且降低成本的巨大優(yōu)勢。

文獻解讀：

與傳統(tǒng)的2D培養(yǎng)方法不同，3D打印支架模型制造的方法可以在各個方向促進增殖和球體的形成。2D培養(yǎng)環(huán)境可能在組織工程領域更相關，因為研究表明，2D所產(chǎn)生的細胞培養(yǎng)與其體內(nèi)的表型在形態(tài)和生理上都不同。這些觀察結果是由于基因表達和信號轉導級聯(lián)導致的細胞反應可能不能預測人體將發(fā)生的事情。因此，利用一種細胞反應被最準確地再現(xiàn)的培養(yǎng)系統(tǒng)在組織再生中是非常重要的，尤其是3D生物打印培養(yǎng)模型在生理相關提供更多的預測數(shù)據(jù)而獲得了越來越多的認可，并且降低了藥物篩選進行體外測試的經(jīng)濟成本，這允許利用大量體外患者特異性藥物測試來減少不可預見的不良反應的風險，從而更準確地預測體內(nèi)反應。

實驗流程及結果：

在Shallu等人的研究中，設計了一種角膜等效物的高通量三維生物打印，這可能會解決體外模型的需要。在該3D角膜模型中，成人角膜的平均尺寸被轉換為3D形狀，然后轉換為G-code文件，由BIOX打印機（CELLINK）打印。為了保持角膜的曲率，采用立體光刻印刷機設計了一個支撐支架模型，該模型可以促進6-12個角膜的打印，從而實現(xiàn)高通量打印。將人角膜角質(zhì)細胞（HCKs）加入到優(yōu)化后的生物墨水中，并打印出負載細胞的角膜基質(zhì)等效物。打印后的結構用100 mM的氯化鈣交聯(lián)，用Hanks平衡鹽溶液洗滌，在成纖維細胞培養(yǎng)基中37°C孵育。

▲ 圖 1. 人角膜基質(zhì)和基底支撐支架模型的構建。(a在Autodesk Fusion 360中建模的角膜基質(zhì)平均尺寸。(b)單孔模型的明場圖像及半徑。(c)6孔角膜模型的3D模型。(d)用預制軟件制備12的打印模型。(e)12孔角膜模型的打印路徑。(f)用BIOX打印機對12個角膜進行高通量打印。(g)交聯(lián)后，放置在介質(zhì)中，打印出的角膜。(h)通過字母“c”顯示其透明的角膜圖片。(i)第一天使用倒置顯微鏡拍攝的3D打印的明場角膜圖像。

對打印出的角膜進行活死試驗、Alamar試驗以及纖維連接蛋白和肌動蛋白綠色標記物的表達進行分析。打印出來的眼角膜能夠保持其結構、完整性和清晰度�；钏涝囼灪虯lamar試驗表明，HCKs在2周內(nèi)保持了高活力（>95%）。打印角膜中的細胞顯示纖維連接蛋白和肌動蛋白綠色的表達。

▲ 圖 2. 評價3D生物打印角膜的細胞活力和免疫熒光染色。(圖a) 在第1天對攜帶人角膜角化細胞（HCKs）的3D打印角膜進行活死實驗（合并圖像）。(圖b) 在第14天，在攜帶HCK細胞的3D打印角膜中進行活死實驗（合并圖像）。(圖c) 第1、5、10和14天在3D打印角膜上的Alamar檢測。使用熒光顯微鏡對3D打印的角膜進行免疫熒光染色，以檢測纖維連接蛋白（紅色（圖d）） 、f-actin（綠色（圖e））、DAPI（藍色（圖f））和合并圖像（圖g）。

儀器使用：CELLINK BIOX

總結：

該研究設計了一個高通量3D打印模型，并為快速打印角膜基質(zhì)模型的可行性建立了方法學。并且優(yōu)化了由膠原蛋白、明膠和海藻酸鈉在生物墨水中的最佳比例配方，打印的角膜透明、光滑，具有所需的曲率，并支持HCKs生長2周。本研究為優(yōu)化和設計高度組織和仿生結構，結合組成和組件設計提供了一條新的途徑，從而可獲得大規(guī)模的3D打印組織模型。