CGRP通過破壞mTOR-Raptor相互作用促進癌癥進展

癌癥由于其極高的患病率和致死率成為一直困擾著我們的問題，目前也有許多治療癌癥的方法，其中饑餓療法由于較低的副作用，吸引了很多人的目光。雖然營養(yǎng)饑餓療法可以在多種癌癥中產(chǎn)生強烈的抗腫瘤作用，已有研究表明癌細胞可以利用腫瘤微環(huán)境 (TME) 在營養(yǎng)不良的環(huán)境中茁壯成長。
 

在今年 12 月 6 日，Cell Metabolism 上發(fā)表了一篇名為 ”Cancer cells co-opt nociceptive nerves to thrive in nutrient-poor environments and upon nutrient-starvation therapies” 的文章。文章表明在口腔粘膜癌的低糖環(huán)境中，癌細胞利用活性氧觸發(fā)的 c-Jun 的激活來分泌神經(jīng)生長因子 (NGF)，NGF 調(diào)節(jié)痛覺神經(jīng)以產(chǎn)生降鈣素基因相關肽 (CGRP)，CGRP 隨后會通過 Rap1 介導的 mTOR-Raptor 相互作用的破壞來誘導癌細胞的細胞保護性自噬 (圖 1)�？固墙徒夂涂寡�管生成的營養(yǎng)饑餓療法都會加劇癌細胞和痛覺神經(jīng)的這種惡性循環(huán)，從而導致痛覺神經(jīng)成為癌癥進展的微環(huán)境的幫兇。

保護性自噬：自噬是癌細胞進行抗癌治療時的一種保護機制，能使癌細胞逃避凋亡。癌細胞對多種抗癌藥物的耐藥性可通過上調(diào)自噬而增加。

饑餓療法：主要是通過阻斷腫瘤的營養(yǎng)供應抑制腫瘤生長。治療策略主要包括：靶向抑制促血管生成因子及其受體和整合素以抗腫瘤血管生成；抑制糖酵解、抑制氨基酸代謝等方式抑制腫瘤細胞代謝過程等。

圖1. 該研究通路機制圖

 
■ 痛覺神經(jīng)存在于 TME 且促進 OSCC 進展
作者通過對口腔鱗狀細胞癌 (OSCC) 小鼠和病人的研究發(fā)現(xiàn)，與正常粘膜相比，不典型增生和浸潤性癌中 TRPV1⁺ 痛覺神經(jīng)密度更高 (圖 2a)。降鈣素基因相關肽 (CGRP) 通常被用作痛覺活性的分子指標，CGRP 在 OSCC 病人組織中的癌癥相關痛覺神經(jīng)中被檢測到，并且 CGRP⁺ 痛覺神經(jīng)比例越高的患者總生存率越低。然而癌細胞本身并不會表達 CGRP，癌癥相關痛覺神經(jīng)的高活性會導致 OSCC 患者的癥狀惡化，在 OSCC 進展中起到重要作用。
為了進一步研究癌癥相關痛覺神經(jīng)對癌癥進展的作用，作者在 BALB/c 裸鼠的舌粘膜下層 (該區(qū)域與痛覺神經(jīng)軸突末梢在解剖學上相鄰) 接種人 OSCC 細胞系 Cal27 或黑素瘤細胞系 B16F10 以建立骨科舌異種移植模型，這些模型中均檢測到了神經(jīng)生態(tài)位和高比例的 CGRP⁺ 神經(jīng)，并且從第 8 天開始，小鼠血漿中鼠 CGRP 緩慢增加 (圖 2b)，這意味著小鼠痛覺活性升高。在用辣椒素 (HY-10448) 對小鼠的痛覺神經(jīng)進行化學去神經(jīng)化后，Cal27 和 B16F10 腫瘤均變小了 (圖 2c)。這些表明癌癥相關痛覺神經(jīng)有助于腫瘤生長。

a: 4-硝基喹啉1-氧化物(4NQO) 誘導的小鼠 OSCC 泛神經(jīng) (PGP9.5+) 和痛覺神經(jīng) (TRPV1+PGP9.5+/PGP9.5+) 密度的定量分析 (Normal mucose: 正常粘液；Dysplasia：不典型增生；Invasive carcinoma：浸潤性腫瘤); b: Cal27 異種移植小鼠在指定時間點血漿中的人鼠 CGRP 水平，鼠CGRP水平顯著升高，人CGRP水平?jīng)]有顯著變化; c: Cal27 和 B16F10 異種舌移植體積，使用辣椒素 (Cap) 處理后腫瘤體積顯著減小

 

■ 痛覺神經(jīng)在低糖環(huán)境下促進癌細胞生長

葡萄糖和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)可以深刻影響 TME 中的癌細胞-基質(zhì)/免疫細胞相互作用。在小鼠異種舌移植模型中，腫瘤組織中葡萄糖含量的下降與鄰近正常組織相比明顯更大，這表明腫瘤在口腔粘膜中快速消耗葡萄糖，同時該模型具有更高水平的應激反應蛋白和糖酵解酶 (圖 3a)，高糖酵解活性可能有助于 OSCC 腫瘤的低糖環(huán)境。在低糖培養(yǎng)條件下用 TG CM (三叉神經(jīng)節(jié)條件培養(yǎng)基) 培養(yǎng)時，所有三種腫瘤細胞系 (HN6、Cal27 和 B16F10) 的生長都得到了促進 (圖 3b)。當癌細胞被給予 2-脫氧-D-葡萄糖 (2-DG, 用于模擬低糖環(huán)境) 時也觀察到類似的效果。此外，在 Cal27 細胞中，TG CM 增加了增殖細胞核抗原 (PCNA) 的水平 (圖 3c)。這些結(jié)果表明，在體外低糖環(huán)境下，痛覺神經(jīng)促進癌細胞增殖。

在小鼠體內(nèi)模型中，痛覺神經(jīng)去神經(jīng)化 (辣椒素處理，Cap dene) 減少腫瘤生長，瘤內(nèi)葡萄糖含量的增加 (30% 葡萄糖水處理) 逆轉(zhuǎn)了去痛覺神經(jīng)化 (nociceptive denervation) 所介導的抗生長作用 (圖 3d)。用辣椒素刺激痛覺神經(jīng)，在低糖環(huán)境 (2-DG) 下顯著促進腫瘤生長 (圖 3e)。這些結(jié)果表明，痛覺神經(jīng)也促進了體內(nèi)低糖環(huán)境下癌細胞的生長。

圖 3. 痛覺神經(jīng)在低糖環(huán)境中促進癌細胞生長

a: 糖酵解和應激反應蛋白水平和組織葡萄糖含量的變化；b: HN6、Cal27 和 B16F10 細胞在指定培養(yǎng)條件下的生長 (n=3)；c: 在指定的培養(yǎng)條件下 24h 時，Cal27 細胞的 PCNA 和裂解的 caspase-3 蛋白水平；d-e: Cal27 異種舌移植模型中經(jīng)不同處理后的腫瘤體積

 

 
■ 在低葡萄糖環(huán)境中介導痛覺神經(jīng)促進癌癥發(fā)展
 

神經(jīng)可以釋放許多分子，包括代謝物、神經(jīng)肽和核酸，以調(diào)節(jié) TME。煮沸的 TG CM 會失去促進癌細胞生長的能力，而用 DNase 和 RNase 預處理的 CM 保留了其促進生長的作用，表明該生長促進作用并不是由核酸介導的。CGRP 通常被用作痛覺活性的分子指標，為了探究低葡萄糖環(huán)境中痛覺神經(jīng)對癌細胞的生長促進作用是否由 CGRP 介導，作者用 Rimegepant (CGRP 受體拮抗劑) 阻斷 CGRP 信號，發(fā)現(xiàn) TG CM (添加三叉神經(jīng)節(jié)的培養(yǎng)基) 介導的細胞生長被顯著抑制 (圖 4a)。用 siRNA 在 Cal27 細胞中敲低 CGRP 結(jié)合相關受體 (RAMP1 和 CLR) 也會抑制 TG CM 的促生長作用。

進一步的體內(nèi)實驗表明，在小鼠瘤內(nèi)注射重組人 CGRP (rhCGRP) 可以拯救去痛覺神經(jīng)化介導的 Cal27 腫瘤生長抑制 (圖 4b)，在 Cal27 細胞中敲除 CLR 也會抑制辣椒素刺激的腫瘤細胞生長。這些結(jié)果表明，神經(jīng)源性 CGRP 在低糖環(huán)境下介導痛覺神經(jīng)對癌細胞的促生長作用。

 

圖 4. 神經(jīng)源性 CGRP 在低糖環(huán)境中介導痛覺神經(jīng)對癌細胞的生長促進作用

a: 體外 Cal27 細胞在指定條件下處理 48 小時的生長情況；b: Cal27 異種舌移植模型腫瘤體積

■ 在人類 OSCC 進展過程中異常升高

為了研究神經(jīng)源性 CGRP 在人類 OSCC 進展過程中的影響，作者對人類 OSCC 組織進行了組織學分析，發(fā)現(xiàn)在具有高 GCRP 神經(jīng)生態(tài)位的近端腫瘤區(qū)域，癌細胞的比例更高。腫瘤組織中 CALCA (編碼 CGRP) 水平較高的患者的生存率更低。與健康人相比，OSCC 患者術(shù)前血漿 CGRP 水平顯著升高。CLR 水平越高，OSCC 患者的總體生存率越差。這些結(jié)果表明，神經(jīng)源性 CGRP 及其受體 CLR 在 OSCC 進展過程中異常升高，并與較差的臨床病理特征和患者結(jié)局相關。

■ 在低糖環(huán)境中誘導癌細胞保護性自噬

為了尋求低糖環(huán)境中痛覺神經(jīng)和神經(jīng)源性 CGRP 促進生長作用的機制，作者比較了與 rhCGRP 孵育或不孵育的 Cal27 細胞的轉(zhuǎn)錄組，以及在高糖培養(yǎng)或低糖培養(yǎng)下的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)僅在低糖培養(yǎng)下改變表達的基因與多種自噬途徑顯著相關。在低葡萄糖培養(yǎng)和 2-DG 處理下，用 TG CM 處理癌細胞可顯著提高 LC3B-II 水平，降低 p62 水平(圖 5a-b)。同樣條件下用 rhCGRP 處理 Cal27 細胞也得到類似結(jié)果，并上調(diào)了Cal27 細胞中自溶酶體和自噬體的數(shù)量，這些增加的自噬通量都可以被 Rimegepant 拮抗。

通過敲低 ATG5 (在自噬形成過程中必不可少) 或 FIP200 (在自噬啟動過程中必不可少) 抑制自噬通量可以顯著拮抗 TG CM 介導的細胞生長促進 (圖 5c)。在體內(nèi)模型中敲低 ATG5 后，不管有沒有 2-DG 處理，去痛覺神經(jīng)化對細胞生長抑制均沒有效果 (圖 5d)。這些結(jié)果表明，在低葡萄糖環(huán)境中，痛覺神經(jīng)促進的癌細胞生長依賴于自噬通量的增加。

 

 

圖 5. 神經(jīng)源性 CGRP 在低糖環(huán)境下通過誘導細胞保護性自噬促進癌細胞生長

a-b: 在指定培養(yǎng)條件下 24 h Cal27 細胞中 LC3B 和 p62 的水平及 LC3B-II 的凈通量；c: 體外 Cal27 細胞在指定培養(yǎng)條件下生長 48 h (n = 3)；d: Cal27 異種舌移植模型在不同處理條件的腫瘤體積 (n = 4-5)

■ 上調(diào) Rap1 介導的 mTOR Raptor 相互作用

研究發(fā)現(xiàn)，在低葡萄糖培養(yǎng)條件下 rhCGRP 孵育的 Cal27 細胞中，與 Rap1-GTPase 信號通路相關的基因明顯上調(diào)，顯著提高了 Rap1-GTP 水平，并激活了典型的下游ERK通路。通過敲除 Rap1B 來抑制 Rap1 激活能顯著拮抗 CGRP 介導的自噬誘導，并增加 Cal27 細胞中的 PCNA (一種增殖標志物) 水平 (圖 6a)。在 2-DG 處理的體內(nèi)模型中，Rap1 的敲低消除了瘤內(nèi)注射 rhCGRP 誘導的生長促進。這些結(jié)果表明，CGRP 誘導的癌細胞保護性自噬依賴于 Rap1-GTPase 信號通路的激活。

Rap1 的過度激活會使 mTOR 通路失活，而這種 mTOR 通路失活已知會激活自噬。作者發(fā)現(xiàn) TG CM 在低糖培養(yǎng)和 2-DG 處理下抑制癌細胞中 mTOR 的磷酸化，這些作用可以被 Rimegepan 拮抗。Rap1 與 Raptor 相互作用，與 rhCGRP 孵育后這種相互作用增強 (圖 6b)。Rap1 和 Raptor 之間的相互作用會阻礙 mTOR 和 Raptor 之間的相互作用，從而阻礙 mTOR 信號的激活 (圖 6c)。這些結(jié)果表明，CGRP 介導的 Rap1 的激活通過破壞 mTOR Raptor 相互作用抑制了 mTOR 的磷酸化。
 

圖 6. 神經(jīng)源性 CGRP 通過 Rap1 介導的 mTOR Raptor 相互作用的破壞誘導癌細胞的細胞保護性自噬

a: 在指定的培養(yǎng)條件下 24 小時，Cal27 細胞 LC3B 和 p62 水平的變化; b, c: 在 Cal27 細胞中，Raptor 與 Rap1 以及 Raptor 與 mTOR 的相互作用

■ 在低糖環(huán)境下，癌細胞利用痛覺神經(jīng)產(chǎn)生 CGRP

神經(jīng)源性 CGRP 可以在低糖環(huán)境促進癌細胞生長，那么癌細胞是否可以反過來影響TME 中的痛覺神經(jīng)呢？作者發(fā)現(xiàn)，與 Cal27 或 B16F10 細胞共培養(yǎng)可增加 TGs 中的 Calca (編碼 CGRP) 水平，癌細胞的低葡萄糖培養(yǎng)和 2-DG 預處理也會增加 Calca 水平。在低糖培養(yǎng)和 2-DG 處理下，Cal27 和 B16F10 細胞中神經(jīng)生長因子 NGF 水平顯著升高。用 GW-441756 選擇性抑制 NGF 受體不會影響 HN6、Cal27 或 B16F10 細胞的體外生長，但會拮抗癌細胞介導的 TGs 中 Calca 水平的升高。這些結(jié)果表明，癌細胞來源的 NGF 在低糖環(huán)境中促進痛覺神經(jīng) Calca 的轉(zhuǎn)錄，從而促進痛覺神經(jīng)產(chǎn)生 CGRP。

作者進一步發(fā)現(xiàn) c-Jun 是觀察到的人類和小鼠 NGF/ NGF 轉(zhuǎn)錄誘導最有可能的調(diào)節(jié)因子 (圖 7a)。JNK-c Jun 通路可被活性氧激活，Cal27 和 B16F10 細胞中低糖培養(yǎng)和 2-DG 處理后 ROS 水平升高，顯著刺激 JNK-c-Jun 活性 (圖 7b)，被激活的 c-Jun 定位于 Cal27 細胞的 NGF 位點 (圖 7c)，過氧化氫酶預處理抑制了癌細胞 NGF 分泌升高 (圖 7d)。這些結(jié)果表明，在低糖環(huán)境下，癌細胞分泌 NGF 依賴于 JNK-c-Jun 通路。

 

圖 7. 在低糖環(huán)境下，癌細胞利用痛覺神經(jīng)產(chǎn)生 CGRP

a: 確定 c-Jun 為人類和小鼠 NGF/ NGF 轉(zhuǎn)錄因子的 TOP1 候選因子；b: 在指定的培養(yǎng)條件下 2 h, 對 Cal27 細胞 JNK-c-Jun 通路的 IB 分析；c: 在指定培養(yǎng)條件下，在 Cal27 細胞 NGF 啟動子上進行 c-Jun 的 ChIP-qPCR 檢測；d: 在指定培養(yǎng)條件下 24 h，Cal27 細胞分泌 NGF 的情況 (n = 3)

 

 

在低糖環(huán)境中觀察到的癌細胞和痛覺神經(jīng)之間的雙向相互作用表明，打破這種惡性循環(huán)可能會增強營養(yǎng)饑餓療法的治療效果。在兩類營養(yǎng)饑餓療法：糖酵解抑制劑和血管生成抑制劑中，都增加了舌異種移植中的 NGF 水平，增加了 TGs 中 CGRP 含量的上調(diào)。將營養(yǎng)饑餓療法藥物與 Rimegepant 聯(lián)用破壞癌細胞和傷害神經(jīng)之間的相互作用，可以有效地增強營養(yǎng)饑餓療法的抗腫瘤療效。

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參考文獻

Zhang Y, et al. Cancer cells co-opt nociceptive nerves to thrive in nutrient-poor environments and upon nutrient-starvation therapies. Cell Metab. 2022 Dec 6;34(12):1999-2017.e10.