壓電噴墨打印3D肺泡屏障模型與生理相關微結構
在生物打印技術中，壓電噴墨生物打印適合重建薄而復雜的軟組織特征。因為DOD按需打印方法具有分辨率高、打印速度快、高細胞活性、材料浪費低等優(yōu)勢�；贛icroFab噴墨技術的生物打印機可噴射≥0.1pL的微液滴，可對活的哺乳動物細胞進行微圖案化。
隨著新呼吸道病毒的爆發(fā)和肺部疾病的高死亡率，迫切需要人類呼吸系統(tǒng)的生理相關模型來研究疾病發(fā)病機制、藥物療效和藥理學。生物打印技術是可用于制造復雜結構的3D組織模型的新興技術之一。生物打印可以3D方式自動沉積細胞和生物材料，實現(xiàn)組織模型的高度控制和定制生產(chǎn)。生物打印組織工程可以為體外藥物篩選和毒性研究提供更準確的模型。在生物打印技術中，壓電噴墨生物打印 適合重建薄而復雜的軟組織特征。這是因為按需打印方法具有分辨率高、打印速度快、高細胞活性、材料浪費低等生物打印技術的優(yōu)勢。基于噴墨的生物打印機在其噴嘴中包括一個壓電制動器，在電脈沖下在墨水腔內(nèi)產(chǎn)生聲波，以噴射典型體積為1~100pL（10-12L）的微小液滴（MicroFab噴墨技術可實現(xiàn)≥0.1pL的微液滴），噴墨打印的這種能力已被證明能夠在2D和3D環(huán)境中以高精度和速度對活的哺乳動物細胞進行微圖案化。
《All-Inkjet-Printed 3D Alveolar Barrier Model with Physiologically Relevant Microarchitecture》報告了一個全噴墨打印的肺泡屏障模型，功能層上皮和內(nèi)皮細胞與膠原蛋白之間的基底膜。四種類型的人類肺泡細胞的高分辨率模式，即NCI-H1703（肺上皮I型細胞）、NCI-H441（肺上皮II型細胞）、HULEC-5a（肺微血管內(nèi)皮細胞）和MRC5（肺成纖維細胞）以及I型膠原蛋白，通過按需噴墨打印自動高分辨率沉積肺泡細胞，能夠制造出厚度達到≈10μm的三層肺泡屏障模型。結果表明，與傳統(tǒng)的2D細胞培養(yǎng)模型相比，3D結構模型更好地再現(xiàn)了肺組織的結構、形態(tài)和功能，而且與肺泡細胞和膠原蛋白均勻混合的3D非結構模型相比，3D結構模型更好地再現(xiàn)了肺組織的結構、形態(tài)和功能。按需應變噴墨打印技術是一種實現(xiàn)個性化、可擴展制造、尺寸和生長標準化的技術，相信這種3D肺泡屏障模型可以作為病理學和制藥學應用中傳統(tǒng)測試模型的替代方法。
肺泡屏障模型的噴墨生物打印
▲ 圖1 肺泡屏障模型的制作。a）鬼筆環(huán)肽染色的人肺泡細胞系的共聚焦熒光顯微鏡圖像。肌動蛋白呈紅色，細胞核呈藍色。比例尺：50µm。b）制作肺泡屏障模型的噴墨打印工藝示意圖。這些細胞均采用噴墨打印，逐層打印。此圖像是使用BioRender創(chuàng)建的。
圖1顯示了肺泡細胞系的類型和噴墨打印工藝制造的超薄三層肺泡屏障模型。以人肺細胞系NCI-H1703為扁平鱗狀上皮AT I，NCI-H441為立方形AT II，內(nèi)皮細胞 HULEC-5a和MRC5為成纖維細胞。圖1a中的共聚焦熒光顯微鏡圖像顯示了每種細胞類型的形態(tài)。通過這些細胞和膠原蛋白的噴墨打印完成了薄的三層肺泡屏障模型的制作（圖1b）。在transwel滲透性支持物中，內(nèi)皮細胞墨水、膠原蛋白墨水和含有成纖維細胞的膠原蛋白墨水按順序一層一層地打印。內(nèi)皮細胞墨水首先噴墨打印到transwel插入物的多孔膜上。孵育24小時后，膠原蛋白和成纖維細胞拉伸的膠原墨水印在內(nèi)皮層上。在培養(yǎng)箱中將膠原蛋白完全交聯(lián)24小時后，將數(shù)量為1:2的AT I和AT II上皮細胞均勻地放置在下層。除膠原基油墨在4°c的溫度下打印以防止其在噴射過程中發(fā)生交聯(lián)外，其余打印工藝均在室溫下進行。采用全噴墨打印的肺泡模型，將肺泡上皮暴露于空氣中培養(yǎng)14天，并對其結構和生理功能進行進一步評價和分析。
噴墨細胞打印工藝優(yōu)化
首先，課題組為每個單元格類型開發(fā)了可靠的噴墨工藝。NCI-H1703、NCI-H441和HULEC-5a細胞的生物油墨在細胞生長介質中制備，MRC5細胞被懸浮在稀釋的膠原蛋白墨水中。圖2a顯示生物油墨的單閃光噴射圖像。這些生物墨水都用80μm大小的壓電噴嘴頭噴射出來，噴射速度為3ms-1。調整的雙極演化波形和氣動壓力使細胞液滴具有高分辨率和穩(wěn)定性的模式。在這些實驗中，它的上升、下降和停留時間被設定在10μs左右，峰值驅動電壓為±80V。
▲ 圖2 優(yōu)化噴墨生物打印參數(shù)。a）用直徑為80μm的壓電噴嘴對人體肺泡細胞進行噴墨打印的單閃光圖像。比例尺：100μm。b）代表圖像，8×8個細胞液滴陣列印在玻璃基板上，間距為500μm。小圖：放大2×2陣列。c）每個液滴的平均細胞數(shù)32×32陣列中。
接下來，課題組檢查了單個pL級液滴中的打印細胞數(shù)量，以操縱沉積在每層肺泡組織上的細胞的準確數(shù)目。為此，研究人員在玻璃基板上打印了32×32液滴的陣列，每個單元的濃度為3×106和6×106個細胞mL-1。圖2b顯示了具有代表性的8×8張打印細胞圖像。在圖2c中，每個細胞類型的平均發(fā)射細胞數(shù)量為下降。在放大的2×2陣列圖像中，細胞生長介質墨水中的液滴中的細胞比膠原蛋白墨水少。在計算每個液滴上平均攜帶的細胞數(shù)量（圖2c）時，課題組發(fā)現(xiàn)當細胞生長培養(yǎng)基墨水中的濃度為6×106個細胞mL-1時，大約一個細胞被打印在液滴中。對于稀釋的膠原蛋白墨水，單個細胞的濃度為3×106個細胞mL-1，課題組根據(jù)這些條件確定每種細胞墨水的濃度，以制造分辨率高、精度高的3D肺泡模型。噴墨打印單元的可行性評估
為了調查通過微米大小的噴射對細胞生存性和增殖的任何潛在影響，連續(xù)7天在打印后立即進行生存/死亡檢測和CCK-8 檢測。圖3a顯示通過分析染色鈣黃綠素乙酰氧基甲酯（綠色、活細胞）和溴乙啡錠二聚體1（紅色、死細胞）的細胞群而獲得的細胞生存能力。結果表明，打印組的細胞存活率高達>90%，接近手動移液器吸取質控組的值。在這項研究中，所有人類細胞類型的存活率都很高。圖3b顯示打印和對照組在一周內(nèi)每個細胞系的增殖率。在實驗中，打印細胞組跟隨著移液器對照組的生長趨勢，沒有觀察到任何明顯的細胞死亡，表明噴墨生物打印對正在使用的肺泡細胞沒有不利影響。
▲ 圖3 打印后細胞生存能力測試。a）執(zhí)行生存/死亡檢測，以確定打印后細胞的可行性（n=3）。b）執(zhí)行CCK-8檢測以評估打印后7天的細胞增殖（n=3）。
噴墨生物打印系統(tǒng)
生物油墨以液滴形式噴射，噴墨生物打印系統(tǒng)（Jetlab Ⅱ; MicroFab, TX）基于壓電打印技術，包括x-y電動工作臺和一個高分辨率（±2μm）沿z軸移動的噴嘴。采用80μm噴口直徑（MJ-ATP-01-80; Microfab）噴墨打印頭。系統(tǒng)中的油墨儲存器和噴頭的溫度由一個帶有冷凍循環(huán)槽的集成冷卻系統(tǒng)精心控制。與電壓施加相關的參數(shù)被調整以控制液滴的大小和直線度。通過±80V的JetDrive控制器（MicroFab）給壓電元件施加雙極性電壓波形，其上升、停頓和下降時間分別為≈10μs。將液滴速度調整到3ms-1。x-y運動平臺的速度和加速度分別為15mms-1和500mms-2。單元陣列和模式是從單色位圖圖像中打印出來的。通過控制打印液滴的數(shù)量、生物油墨的細胞濃度以及液滴之間的距離，可以調整噴墨打印要打印的細胞數(shù)量。為了防止細胞在打印過程中沉淀，每隔10分鐘用吸管重新懸浮載細胞的墨水。
參考文獻：
[1] Kang D , Ju A P , Kim W , et al. All‐Inkjet‐Printed 3D Alveolar Barrier Model with Physiologically Relevant Microarchitecture[J]. Advanced Science, 2021.
