微量樣本RNA甲基化m6A技術(shù)的比較
在哺乳動物mRNA中，N6-甲基腺苷（m6A）約占所有腺苷的0.2％至0.6％，是豐度最高的mRNA修飾。RNA免疫沉淀后通過高通量測序（MeRIP-seq），是轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)檢測m6A修飾位置最為有力的技術(shù)方法。常規(guī)免疫沉淀富集需要上百微克的總RNA，這限制了其在許多領(lǐng)域的應(yīng)用。微量MeRIP技術(shù)優(yōu)化實(shí)驗過程中的關(guān)鍵參數(shù)，包括RNA的起始量，RNA片段化，抗體選擇，MeRIP洗滌/洗脫條件，RNA文庫構(gòu)建方法和生物信息學(xué)分析流程，實(shí)現(xiàn)最低500ng總RNA分析轉(zhuǎn)錄組m6A修飾分布。通過2個肺腺癌（ADC）患者樣本測試鑒定出大約12000個高信噪比（S/N）的m6A峰。通過對同一患者樣本分析轉(zhuǎn)錄組、表觀轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，從m6A水平解釋了該腫瘤mRNA表達(dá)和蛋白質(zhì)翻譯水平差異的動力學(xué)原因。
研究現(xiàn)狀
表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)是基于RNA生物化學(xué)修飾的，影響轉(zhuǎn)錄組功能相關(guān)的表觀改變，是研究轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控的新方向。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)150多種RNA修飾。自20世紀(jì)70年代第一次發(fā)現(xiàn)以來，N6-甲基腺苷（m6A）是哺乳動物mRNA最豐富的修飾形式之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)，m6A的修飾位點(diǎn)，功能和分子機(jī)制是可逆的，調(diào)控是動態(tài)控制的，調(diào)控RNA生命周期的多個環(huán)節(jié)，包括RNA剪接，RNA衰減，miRNA前體加工和蛋白質(zhì)翻譯等。
研究發(fā)現(xiàn)mRNA動態(tài)m6A修飾與干細(xì)胞的分化和重編程，熱休克應(yīng)激，DNA損傷應(yīng)答，性發(fā)育以及生物鐘的速度密切相關(guān)。此外，最近的研究表明，m6A修飾紊亂與癌癥的起始和發(fā)展密切相關(guān)。m6A關(guān)鍵酶的表達(dá)，包括m6A形成酶（writers）、識別酶（readers）以及去除酶（erasers）均在多種腫瘤中發(fā)生改變。低氧誘導(dǎo)m6A去甲基化酶ALKBH5上調(diào)導(dǎo)致干細(xì)胞標(biāo)記基因NANOG的mRNA去甲基，導(dǎo)致的NANOG表達(dá)升高，乳腺癌干細(xì)胞腫瘤形成能力增加。此外，ALKBH5通過增強(qiáng)FOXM1的mRNA表達(dá)，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖和腫瘤發(fā)生中也起著重要作用，F(xiàn)OXM1是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞自我更新的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。同樣，m6A的脫甲基酶FTO和甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3分別在急性骨髓性白血病和肺癌中顯示出致癌功能。
m6A RNA免疫沉淀后進(jìn)行二代測序（m6A MeRIP-seq）可以在轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)鑒定m6A修飾。在人類細(xì)胞中，已鑒定出超過10000個m6A修飾位點(diǎn)分布在大約7000個蛋白質(zhì)編碼基因和非編碼RNA的轉(zhuǎn)錄本中。盡管在過去的幾年中已經(jīng)對該技術(shù)進(jìn)行了數(shù)項改進(jìn)，并且已有商業(yè)化m6A MeRIP試劑盒，RNA的起始量仍需要數(shù)百微克。這限制了m6A表觀轉(zhuǎn)錄組分析在臨床樣本中的應(yīng)用。因此，盡管m6A是哺乳動物mRNA中最豐富的內(nèi)部修飾，但是由于缺乏有效的分析方法，m6A修飾在人類疾病中的作用和動力學(xué)原因仍然知之甚少。以下通過優(yōu)化測試MeRIP不同實(shí)驗參數(shù)，包括RNA起始量、RNA片段化、抗體篩選、MeRIP洗滌/洗脫條件、RNA文庫構(gòu)建方法，以及生信分析流程等，運(yùn)用2ug的肺癌病人腫瘤組織總RNA，檢測到12000個高信噪比的m6A富集峰。
洗滌/洗脫條件的優(yōu)化
化學(xué)打斷是m6A MeRIP的第一個步驟。高溫可使m1A通過Dimroth重排轉(zhuǎn)化為m6A，RNA通過70℃而不是94℃片段化可盡可能降低m1A到m6A的重排轉(zhuǎn)化。此外，為了將RNA起始量降低至微克級別，運(yùn)用總RNA代替富集后的mRNA進(jìn)行片段化，并且RNA片段化范圍調(diào)整為200nt左右，降低樣本純化丟失。將RNA片段化在200nt的回收效率是100nt的近3倍。
圖1
目前MeRIP可概括為兩種主流技術(shù)流程。第一種流程如圖1A方法Ⅱ所示，免疫沉淀（IP）富集后，使用低/高鹽洗滌，最后洗脫整個抗體-磁珠復(fù)合體。第二種流程如圖1A方法Ⅲ所示，IP富集后，使用IP反應(yīng)緩沖液洗滌，最后通過游離m6A競爭性洗脫m6A修飾RNA片段，這種方法在領(lǐng)域內(nèi)應(yīng)用廣泛。為了比較這兩種流程的IP效能，首先使用等量混合的m6A修飾對照RNA(GLuc)和未修飾對照RNA(CLuc)進(jìn)行MeRIP實(shí)驗。 GLuc RNA對照是體外以20% m6ATP和80% ATP為底物的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。圖1A中的方法Ⅰ作為外加對照，該對照使用NEB抗體，用IP反應(yīng)緩沖液洗滌并洗脫整個抗體-磁珠復(fù)合物。方法Ⅱ使用低/高鹽洗滌，產(chǎn)生較高的信噪比（圖1B）。 方法Ⅱ中將洗脫的RNA進(jìn)行兩輪IP反應(yīng)，進(jìn)一步提高了富集信噪比(圖1C)。進(jìn)一步將32μg人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的RNA樣品與0.1f mol的GLuc和CLuc RNA混合，使用方法II進(jìn)行MeRIP富集，基于已發(fā)表數(shù)據(jù)，將SETD7和GAPDH分別作為陽性和陰性對照，單經(jīng)一輪IP富集后，GLuc/CLuc和SETD7/GAPDH的信噪比都高達(dá)100倍左右 (圖1D和1E)。經(jīng)過兩輪IP富集后，GLuc/CLuc和SETD7/GAPDH的信噪比進(jìn)一步提升(圖1D和1E)，但是產(chǎn)率顯著降低約66%。
Anti-m6A抗體對m6A MeRIP效率影響對比
為進(jìn)一步比較m6A抗體的保真度，選擇Synaptic Systems (SySy)，NEB和Millipore三個公司的抗體用于對比。每個IP富集的RNA投入量為32μg的A549細(xì)胞系總RNA混合0.1f mol的GLuc和CLuc RNA對照。SySy抗體富集RNA的產(chǎn)量是NEB或Millipore的兩倍。三種抗體富集，通過GLuc/CLuc和SETD7/GAPDH測定的信噪比值均較高，而NEB和Millipore的比值均在100以上（圖2A）。
圖2
圖3
不同RNA起始量MeRIP-seq結(jié)果比較
使用Millipore抗體測試不同起始量總RNA (32ug、12ug、6ug、2ug、1ug和0.5ug)的m6A MeRIP效率。SETD7/GAPDH信噪比隨著總RNA起始量的減少而逐漸降低，重復(fù)性如0.5ug總RNA起始展示的，呈現(xiàn)較好（r=0.9）。提高RNA的起始量可相應(yīng)增加m6A檢測峰的數(shù)量，除了0.5ug RNA外，檢測峰的數(shù)量均在20M左右的測序數(shù)據(jù)下達(dá)到平臺期，而0.5ug總RNA的富集在10M左右即到達(dá)平臺期（圖3A）。與2ug總RNA富集相比，32ug，12ug和6ug總RNA富集測序，隨著RNA起始量的提升，m6A唯一檢測峰的數(shù)量隨之增加（圖3B）。此外，在32ug起始RNA富集文庫中，m6A重疊檢測峰相關(guān)基因（N=1579）的平均表達(dá)水平顯著高于m6A唯一檢測峰相關(guān)基因（N=2168）的平均表達(dá)水平（圖3C），表明低豐度m6A修飾RNA峰可以通過增加RNA起始量通過MeRIP測序檢測出來。
2ug總RNA起始檢測到的終止密碼子附近m6A峰和m6A修飾核心基序特征與高起始RNA富集相似（圖3D）。2ug文庫數(shù)據(jù)特征也與300ug RNA常規(guī)富集對照數(shù)據(jù)相似。2ug總RNA分別使用5ug、1ug和0.2ug Millipore抗體進(jìn)行富集，結(jié)果顯示降低抗體的量會升高信噪比，但是富集到的RNA產(chǎn)量也會降低。
參考文獻(xiàn)
1. ZengY,WangS,GaoS,SoaresF,Ahmed M,GuoH,etal.(2018) Refined RIP-seq protocol for epitranscriptome analysis with low input materials.PLoSBiol16(9):e2006092.
2. Batista PJ. The RNA Modification N(6)-methyladenosine and Its Implications in Human Disease. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2017.
3. Yue Y, Liu J, He C. RNA N6-methyladenosine methylation in post-transcriptional gene expression regulation. Genes Dev. 2015; 29: 1343–1355.
研究現(xiàn)狀
表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)是基于RNA生物化學(xué)修飾的，影響轉(zhuǎn)錄組功能相關(guān)的表觀改變，是研究轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控的新方向。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)150多種RNA修飾。自20世紀(jì)70年代第一次發(fā)現(xiàn)以來，N6-甲基腺苷（m6A）是哺乳動物mRNA最豐富的修飾形式之一。近年來研究發(fā)現(xiàn)，m6A的修飾位點(diǎn)，功能和分子機(jī)制是可逆的，調(diào)控是動態(tài)控制的，調(diào)控RNA生命周期的多個環(huán)節(jié)，包括RNA剪接，RNA衰減，miRNA前體加工和蛋白質(zhì)翻譯等。
研究發(fā)現(xiàn)mRNA動態(tài)m6A修飾與干細(xì)胞的分化和重編程，熱休克應(yīng)激，DNA損傷應(yīng)答，性發(fā)育以及生物鐘的速度密切相關(guān)。此外，最近的研究表明，m6A修飾紊亂與癌癥的起始和發(fā)展密切相關(guān)。m6A關(guān)鍵酶的表達(dá)，包括m6A形成酶（writers）、識別酶（readers）以及去除酶（erasers）均在多種腫瘤中發(fā)生改變。低氧誘導(dǎo)m6A去甲基化酶ALKBH5上調(diào)導(dǎo)致干細(xì)胞標(biāo)記基因NANOG的mRNA去甲基，導(dǎo)致的NANOG表達(dá)升高，乳腺癌干細(xì)胞腫瘤形成能力增加。此外，ALKBH5通過增強(qiáng)FOXM1的mRNA表達(dá)，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤增殖和腫瘤發(fā)生中也起著重要作用，F(xiàn)OXM1是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞自我更新的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。同樣，m6A的脫甲基酶FTO和甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3分別在急性骨髓性白血病和肺癌中顯示出致癌功能。
m6A RNA免疫沉淀后進(jìn)行二代測序（m6A MeRIP-seq）可以在轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)鑒定m6A修飾。在人類細(xì)胞中，已鑒定出超過10000個m6A修飾位點(diǎn)分布在大約7000個蛋白質(zhì)編碼基因和非編碼RNA的轉(zhuǎn)錄本中。盡管在過去的幾年中已經(jīng)對該技術(shù)進(jìn)行了數(shù)項改進(jìn)，并且已有商業(yè)化m6A MeRIP試劑盒，RNA的起始量仍需要數(shù)百微克。這限制了m6A表觀轉(zhuǎn)錄組分析在臨床樣本中的應(yīng)用。因此，盡管m6A是哺乳動物mRNA中最豐富的內(nèi)部修飾，但是由于缺乏有效的分析方法，m6A修飾在人類疾病中的作用和動力學(xué)原因仍然知之甚少。以下通過優(yōu)化測試MeRIP不同實(shí)驗參數(shù)，包括RNA起始量、RNA片段化、抗體篩選、MeRIP洗滌/洗脫條件、RNA文庫構(gòu)建方法，以及生信分析流程等，運(yùn)用2ug的肺癌病人腫瘤組織總RNA，檢測到12000個高信噪比的m6A富集峰。
洗滌/洗脫條件的優(yōu)化
化學(xué)打斷是m6A MeRIP的第一個步驟。高溫可使m1A通過Dimroth重排轉(zhuǎn)化為m6A，RNA通過70℃而不是94℃片段化可盡可能降低m1A到m6A的重排轉(zhuǎn)化。此外，為了將RNA起始量降低至微克級別，運(yùn)用總RNA代替富集后的mRNA進(jìn)行片段化，并且RNA片段化范圍調(diào)整為200nt左右，降低樣本純化丟失。將RNA片段化在200nt的回收效率是100nt的近3倍。
圖1目前MeRIP可概括為兩種主流技術(shù)流程。第一種流程如圖1A方法Ⅱ所示，免疫沉淀（IP）富集后，使用低/高鹽洗滌，最后洗脫整個抗體-磁珠復(fù)合體。第二種流程如圖1A方法Ⅲ所示，IP富集后，使用IP反應(yīng)緩沖液洗滌，最后通過游離m6A競爭性洗脫m6A修飾RNA片段，這種方法在領(lǐng)域內(nèi)應(yīng)用廣泛。為了比較這兩種流程的IP效能，首先使用等量混合的m6A修飾對照RNA(GLuc)和未修飾對照RNA(CLuc)進(jìn)行MeRIP實(shí)驗。 GLuc RNA對照是體外以20% m6ATP和80% ATP為底物的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。圖1A中的方法Ⅰ作為外加對照，該對照使用NEB抗體，用IP反應(yīng)緩沖液洗滌并洗脫整個抗體-磁珠復(fù)合物。方法Ⅱ使用低/高鹽洗滌，產(chǎn)生較高的信噪比（圖1B）。 方法Ⅱ中將洗脫的RNA進(jìn)行兩輪IP反應(yīng)，進(jìn)一步提高了富集信噪比(圖1C)。進(jìn)一步將32μg人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的RNA樣品與0.1f mol的GLuc和CLuc RNA混合，使用方法II進(jìn)行MeRIP富集，基于已發(fā)表數(shù)據(jù)，將SETD7和GAPDH分別作為陽性和陰性對照，單經(jīng)一輪IP富集后，GLuc/CLuc和SETD7/GAPDH的信噪比都高達(dá)100倍左右 (圖1D和1E)。經(jīng)過兩輪IP富集后，GLuc/CLuc和SETD7/GAPDH的信噪比進(jìn)一步提升(圖1D和1E)，但是產(chǎn)率顯著降低約66%。
Anti-m6A抗體對m6A MeRIP效率影響對比
為進(jìn)一步比較m6A抗體的保真度，選擇Synaptic Systems (SySy)，NEB和Millipore三個公司的抗體用于對比。每個IP富集的RNA投入量為32μg的A549細(xì)胞系總RNA混合0.1f mol的GLuc和CLuc RNA對照。SySy抗體富集RNA的產(chǎn)量是NEB或Millipore的兩倍。三種抗體富集，通過GLuc/CLuc和SETD7/GAPDH測定的信噪比值均較高，而NEB和Millipore的比值均在100以上（圖2A）。
圖2
IP富集RNA建庫試劑盒選取
分析市面上RNA測序文庫制備試劑盒后，選用Takara/Clontech公司的SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit (Pico Input Mammalian)用于文庫構(gòu)建。該試劑盒使用針對哺乳動物rRNA逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增后cDNA的特異性探針去除核糖體cDNA，極大降低了低起始量RNA片段化前，直接進(jìn)行rRNA去除或poly(A) 尾富集過程中的RNA丟失。該試劑盒成功用于上述三種抗體IP富集RNA和input RNA的文庫構(gòu)建。三種抗體富集測序數(shù)據(jù)中，SETD7基因轉(zhuǎn)錄本的信噪比趨勢跟RT-QPCR結(jié)果相一致（圖2B）。每個文庫大約檢測到13000個m6A峰，每個基因平均有3個峰。約60%的m6A峰在3種抗體富集文庫中重疊（圖2C）。3種抗體富集文庫測序數(shù)據(jù)量達(dá)到20 M的Reads時，檢測峰的數(shù)量達(dá)到平臺期（圖2D）。m6A峰主要分布在轉(zhuǎn)錄本的終止密碼子附近。3種抗體m6A富集在5種基因組元件中的比例相似（圖2E），m6A信號在終止密碼子附近富集（圖2F）。此外，Millipore和NEB抗體m6A富集具有“GGAC”基序特征（圖2G）。另外，32ug起始RNA文庫數(shù)據(jù)與300ug總RNA起始的m6A文庫數(shù)據(jù)相當(dāng)。
圖3不同RNA起始量MeRIP-seq結(jié)果比較
使用Millipore抗體測試不同起始量總RNA (32ug、12ug、6ug、2ug、1ug和0.5ug)的m6A MeRIP效率。SETD7/GAPDH信噪比隨著總RNA起始量的減少而逐漸降低，重復(fù)性如0.5ug總RNA起始展示的，呈現(xiàn)較好（r=0.9）。提高RNA的起始量可相應(yīng)增加m6A檢測峰的數(shù)量，除了0.5ug RNA外，檢測峰的數(shù)量均在20M左右的測序數(shù)據(jù)下達(dá)到平臺期，而0.5ug總RNA的富集在10M左右即到達(dá)平臺期（圖3A）。與2ug總RNA富集相比，32ug，12ug和6ug總RNA富集測序，隨著RNA起始量的提升，m6A唯一檢測峰的數(shù)量隨之增加（圖3B）。此外，在32ug起始RNA富集文庫中，m6A重疊檢測峰相關(guān)基因（N=1579）的平均表達(dá)水平顯著高于m6A唯一檢測峰相關(guān)基因（N=2168）的平均表達(dá)水平（圖3C），表明低豐度m6A修飾RNA峰可以通過增加RNA起始量通過MeRIP測序檢測出來。
2ug總RNA起始檢測到的終止密碼子附近m6A峰和m6A修飾核心基序特征與高起始RNA富集相似（圖3D）。2ug文庫數(shù)據(jù)特征也與300ug RNA常規(guī)富集對照數(shù)據(jù)相似。2ug總RNA分別使用5ug、1ug和0.2ug Millipore抗體進(jìn)行富集，結(jié)果顯示降低抗體的量會升高信噪比，但是富集到的RNA產(chǎn)量也會降低。
參考文獻(xiàn)
1. ZengY,WangS,GaoS,SoaresF,Ahmed M,GuoH,etal.(2018) Refined RIP-seq protocol for epitranscriptome analysis with low input materials.PLoSBiol16(9):e2006092.
2. Batista PJ. The RNA Modification N(6)-methyladenosine and Its Implications in Human Disease. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2017.
3. Yue Y, Liu J, He C. RNA N6-methyladenosine methylation in post-transcriptional gene expression regulation. Genes Dev. 2015; 29: 1343–1355.
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