CAR分子設(shè)計與慢病毒包裝的應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：664　發(fā)布日期：2023-5-29　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責任自負

歷經(jīng)多年發(fā)展，嵌合抗原受體CAR-T細胞療法已成為癌癥治療的革命性方法，其中，CD19靶點藥物在治療B細胞惡性腫瘤方面更是取得了前所未有的成功，并于2017年獲得美國FDA批準。其中，CAR分子設(shè)計及病毒包裝是影響CAR-T細胞治療有效性的重要環(huán)節(jié)，在前幾期文章里，我們集中梳理了以下幾個要點：

介紹CAR結(jié)構(gòu)及其設(shè)計原則
盤點CAR-T細胞治療的局限性及潛在風險
如何打破困局、提升治療效果的創(chuàng)新策略

今天結(jié)合具體的研究案例數(shù)據(jù)，為大家展示在實際的應(yīng)用情境中，我們可以如何更好地了解進而優(yōu)化CAR分子設(shè)計、載體構(gòu)建及病毒包裝等一系列工藝流程。

CAR分子設(shè)計
CAR分子全稱為嵌合抗原受體，其結(jié)構(gòu)包括信號肽分子，抗體來源的單鏈可變區(qū)、鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)，共刺激分子結(jié)構(gòu)域、CD3ζ信號轉(zhuǎn)導域。

scFv篩選：scFv親和力和特異性對CAR分子功能有重要影響，篩選合適的scFv十分重要
連接基團（Linker）的優(yōu)化：設(shè)計不同長度的Linker，使V_H和V_L之間的靈活度增加，進而影響結(jié)合親和力
鉸鏈區(qū)（Hinge）的優(yōu)化：設(shè)計不同長度的Hinge，增加抗原結(jié)合域的空間靈活度
共刺激結(jié)構(gòu)域的選擇：可選擇不同的共刺激分子（如4-1BB或CD28等）
報告基因：可連接綠色熒光蛋白基因，表征CAR分子是否轉(zhuǎn)導成功

CAR分子設(shè)計與慢病毒包裝
CAR分子結(jié)構(gòu)示意圖

表1 CAR分子設(shè)計中常用原件

載體構(gòu)建
在設(shè)計好CAR分子后，通常需要對其進行基因合成并亞克隆至慢病毒穿梭質(zhì)粒上，構(gòu)建后的其結(jié)構(gòu)通常如圖所示。賽業(yè)生物可以提供多種現(xiàn)貨型的CAR慢病毒質(zhì)粒載體庫，靶點包括人的CD19、BCMA、GPC3、FAP和HER2等，且該載體庫還在不斷的豐富和更新中。

CAR分子設(shè)計與慢病毒包裝
CAR慢病毒載體結(jié)構(gòu)圖示

病毒包裝和純化
賽業(yè)生物在慢病毒制備方面具有多年的經(jīng)驗，可以提供多樣化的慢病毒制備服務(wù)。我們使用了安全性高的第三代慢病毒包裝系統(tǒng)，其制備流程如圖所示。

CAR分子設(shè)計與慢病毒包裝
慢病毒包裝技術(shù)路線

解決策略推薦
基于多年在腫瘤免疫領(lǐng)域的研究經(jīng)驗，賽業(yè)生物可為CAR-T/其它細胞治療研究者提供專業(yè)的CAR分子設(shè)計及載體構(gòu)建、CAR慢病毒制備、靶抗原穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建等服務(wù)。

豐富的CAR分子設(shè)計經(jīng)驗，可提供專業(yè)的各種定制化的CAR分子設(shè)計服務(wù)
豐富的CAR慢病毒質(zhì)粒載體庫，可提供快速優(yōu)質(zhì)的服務(wù)
抗原高表達、高穩(wěn)定性的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株構(gòu)建服務(wù)
高滴度高純度的慢病毒制備
嚴格的質(zhì)控標準

不僅如此，我們能給予你關(guān)于CAR-T/其他細胞治療研發(fā)的全方位支持，從抗體開發(fā)、CAR病毒制備、免疫細胞制備和表型檢測，到細胞模型與動物模型的構(gòu)建、體外/體內(nèi)藥效評價一應(yīng)俱全。

服務(wù)案例

CD19抗原慢病毒滴度檢測

將表達CD19抗原的慢病毒純化液進行梯度稀釋（0.01、0.1、1、10μL四個梯度），分別加入到相同數(shù)量的293T細胞中，72小時后流式檢測293T細胞陽性率(即被慢病毒感染的293T細胞占細胞總數(shù)的百分比)，進而計算慢病毒的轉(zhuǎn)導滴度。如圖所示，CD19抗原陽性細胞的數(shù)量隨轉(zhuǎn)染病毒梯度的增加而逐漸升高，表明該慢病毒有良好的感染活性，并計算病毒滴度為：1.4×10⁸ TU/mL。

CAR分子設(shè)計與慢病毒包裝
CD19抗原慢病毒滴度檢測結(jié)果