MicroFab的應(yīng)用：在蠶絲上噴墨打印制備微圖案圖層用于細(xì)胞生長(zhǎng)引導(dǎo)

常州大學(xué)藥學(xué)院生物材料與納米醫(yī)學(xué)課題組負(fù)責(zé)人招秀伯教授利用MicroFab的Jetlab 4xL噴墨打印系統(tǒng)在RSF表面上圖案化自組裝的I3K肽納米纖維，以定向控制PC12細(xì)胞的生長(zhǎng)。研究表明肽微圖案可以有效地引導(dǎo)RSF支架表面的細(xì)胞排列和組織，為神經(jīng)再生應(yīng)用提供了巨大的潛力。

介紹
人類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)由中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）和外周神經(jīng)系統(tǒng)（PNS）組成，它們很容易受到創(chuàng)傷和車(chē)禍等傷害以及阿爾茨海默病、帕金森病、中風(fēng)和腦瘤等疾病的損害，開(kāi)發(fā)用于神經(jīng)組織再生的明確功能支架以幫助指導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞附著、排列、擴(kuò)散和增殖至關(guān)重要。微圖案化技術(shù)已經(jīng)引起了人們的關(guān)注，它可以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞排列的幾何控制。噴墨打印是一種成本效益高且靈活的微圖案化技術(shù)，能夠以高精度圖案化復(fù)雜的幾何形狀。招秀伯教授團(tuán)隊(duì)利用MicroFab的噴墨打印系統(tǒng)Jetlab 4xl在再生絲素蛋白（RSF）表面圖案化自組裝肽納米纖維，以指導(dǎo)神經(jīng)元PC12細(xì)胞的生長(zhǎng)，如圖1所示。

▲ 圖1 微圖案引導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)研究示意圖。
 

MicroFab的Jetlab 4xl噴墨打印系統(tǒng)配有60μm的噴頭，使用90V的電壓、300Hz的頻率打印I₃K肽納米纖維墨水，打印高度約為10mm。為了研究打印的I₃K肽納米纖維圖案對(duì)PC12細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，打印形成了圖案“SHEF”，如圖2所示。通過(guò)將自組裝的I₃K肽納米纖維噴墨打印到RSF基底上來(lái)對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行微圖案化，可以提供一種好的方法來(lái)分析體外軸突發(fā)育。
 

▲ 圖2 A. 使用I₃K肽（3mg/mL）作為墨水，在RSF涂層的玻璃表面（40mg/mL）上噴墨打印1層“SHEF”字母，PC12神經(jīng)元細(xì)胞沿著打印的字母生長(zhǎng)；B. 放大的字母“HE”（比例尺500μm)。

細(xì)胞粘附過(guò)程的第一步是細(xì)胞-聚合物相互作用，這對(duì)細(xì)胞通訊、調(diào)節(jié)、組織發(fā)育和維持至關(guān)重要，通過(guò)AFM對(duì)附著在不同比例的RSF/I₃K支架上的細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行了研究，細(xì)胞在僅I₃K涂覆的表面上顯示出極好的鋪展如圖3a所示，而在僅RSF涂覆的表面幾乎沒(méi)有鋪展其末端如圖3b所示。圖3（d-g）通過(guò)將沉積在RSF（40mg/mL）涂層表面上的I₃K的濃度從2mg/mL增加到4mg/mL，細(xì)胞擴(kuò)散顯著改善，表明細(xì)胞擴(kuò)散的肽濃度依賴性。FITC、phalloidin和DAPI分別用于染色肌動(dòng)蛋白絲和細(xì)胞核，以進(jìn)一步表征粘附在RSF/I₃K支架上的細(xì)胞的形態(tài)，如圖4所示。
 

▲ 圖3 附著在一系列RSF和I₃K涂層表面的PC12神經(jīng)元細(xì)胞的AFM峰值力誤差圖像。
 

▲ 圖4 附著在不同比例RSF/I₃K涂層表面的PC12神經(jīng)元細(xì)胞的F-肌動(dòng)蛋白染色。

PC12細(xì)胞在樣品表面（I型膠原；RSF；RSF/I₃K 40:3和RSF/I₃K 40:4）上的代謝活性在培養(yǎng)24、72和144小時(shí)后使用雷沙蘇林測(cè)定法測(cè)定，如圖5所示。在所有表面上觀察到代謝活性在24至144小時(shí)之間逐漸增加，對(duì)于RSF/I₃K支架，代謝活性增加更多，表明I₃K可以促進(jìn)PC12細(xì)胞增殖，涂層表面上有極好的細(xì)胞增殖。

▲ 圖5 雷沙蘇林測(cè)定法評(píng)估粘附著在不同表面上的PC12細(xì)胞的代謝活性。

結(jié)論
使用I₃K肽納米纖維作為細(xì)胞吸引劑來(lái)修飾RSF支架表面，以促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞（PC12細(xì)胞）的附著和生長(zhǎng)，I₃K肽的存在促進(jìn)了PC12細(xì)胞的結(jié)合效率，帶正電荷的賴氨酸殘基促進(jìn)了細(xì)胞附著。噴墨打印已被證明是用于引導(dǎo)細(xì)胞附著的好的微圖案方法，為分析和理解基本細(xì)胞功能（如軸突發(fā)育和細(xì)胞-細(xì)胞相互作用）提供了一種很有前途的方法。

參考文獻(xiàn)：
[1] Sun W ,  Taylor C S ,  Zhang Y , et al. Cell Guidance on Peptide Micropatterned Silk Fibroin Scaffolds[J]. Journal of Colloid and Interface Science, 2021, 603(6).