Moxi GO II快速流式細(xì)胞儀在單細(xì)胞測(cè)序中的應(yīng)用

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)首次問(wèn)世于2009年，十幾年來(lái)不斷完善和發(fā)展，尤其在近幾年出現(xiàn)爆發(fā)式突破和應(yīng)用普及。不同于傳統(tǒng)的多細(xì)胞層面，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)聚焦于單個(gè)細(xì)胞，是對(duì)單個(gè)細(xì)胞在基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀基因組及蛋白組等水平進(jìn)行測(cè)序分析的技術(shù)，反映了細(xì)胞間的異質(zhì)性。此外，單細(xì)胞平臺(tái)一次性可以分離、分析幾千個(gè)單細(xì)胞，有助于分類或定義新的細(xì)胞類型。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和更新，為研究解析單個(gè)細(xì)胞的行為、機(jī)制、與機(jī)體的關(guān)系等提供了方向，為早期檢測(cè)、診斷疾病及疾病個(gè)體化治療提供指導(dǎo)。

與傳統(tǒng)測(cè)序相比，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)更為困難和復(fù)雜，存在樣本量小、RNA降解快、噪聲和批次效應(yīng)等問(wèn)題，需要特殊的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)處理和分析方法，每次實(shí)驗(yàn)都會(huì)耗費(fèi)大量的時(shí)間、費(fèi)用以及無(wú)形的機(jī)會(huì)成本。因此單細(xì)胞測(cè)序平臺(tái)都非常強(qiáng)調(diào)樣品制備的重要性，包括精確測(cè)量細(xì)胞濃度、活率以及確定樣本組成等，這些參數(shù)決定了下游實(shí)驗(yàn)的成敗。

Moxi GO II快速流式細(xì)胞儀
美國(guó)Orflo Technologies公司將行業(yè)公認(rèn)的細(xì)胞計(jì)數(shù)金標(biāo)準(zhǔn)——庫(kù)爾特原理（Coulter Principle），與熒光流式檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，推出的新一代快速流式細(xì)胞儀——Moxi GO II，提供超準(zhǔn)確的細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞活率檢測(cè)，以及超高分辨率的細(xì)胞粒徑測(cè)量，可用于評(píng)估樣本純度、準(zhǔn)確的細(xì)胞核計(jì)數(shù)和細(xì)胞表型分析，非常適用于單細(xì)胞測(cè)序中細(xì)胞樣本制備的質(zhì)控。
何為庫(kù)爾特原理？
細(xì)胞/顆粒和緩沖液導(dǎo)電性不同，在恒定電流設(shè)計(jì)的電路中，懸浮在緩沖液中的顆粒/細(xì)胞隨緩沖液通過(guò)小孔管時(shí)，取代相同體積的緩沖液，從而導(dǎo)致小孔管內(nèi)外兩電極間電阻發(fā)生瞬時(shí)變化，產(chǎn)生電位脈沖。脈沖信號(hào)的大小和次數(shù)與顆粒的大小和數(shù)目成正比。
庫(kù)爾特原理對(duì)顆粒個(gè)體進(jìn)行逐個(gè)三維測(cè)量，不但能準(zhǔn)確測(cè)量顆粒的粒徑分布，更能進(jìn)行粒子絕對(duì)數(shù)目和濃度的測(cè)量。由于檢測(cè)時(shí)不受激光衍射、散射因樣本顏色或濃度變化的影響，庫(kù)爾特原理所測(cè)粒徑大小更接近真實(shí)。

Moxi Go II的性能

• 卓越的細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率檢測(cè)能力

采用庫(kù)爾特原理的Moxi GO II系統(tǒng)可對(duì)樣本中的細(xì)胞進(jìn)行逐個(gè)計(jì)數(shù)和體積測(cè)量，幾秒鐘內(nèi)計(jì)數(shù)多達(dá)40000個(gè)細(xì)胞，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的準(zhǔn)確性和可靠性遠(yuǎn)高于成像類細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（每次只檢測(cè)幾百個(gè)細(xì)胞）。此外，Moxi GO II還配備了488nm激光激發(fā)光源及兩個(gè)PMT熒光檢測(cè)通道，能夠進(jìn)行基于碘化丙啶（PI）熒光染料的細(xì)胞活率檢測(cè)，其檢測(cè)靈敏度、準(zhǔn)確度與流式細(xì)胞儀相當(dāng)，遠(yuǎn)高于成像類細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（如圖3所示）。Moxi GO II細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性和一致性，為單細(xì)胞測(cè)序中細(xì)胞樣本的質(zhì)控提供了可靠依據(jù)。

• 無(wú)與倫比的粒徑分辨率

成像類細(xì)胞計(jì)數(shù)儀基于2D圖像分析，通過(guò)軟件算法識(shí)別細(xì)胞邊界以確定細(xì)胞直徑，這種方法依賴成像效果，不確定因素多，易出現(xiàn)“誤判”，如將碎片識(shí)別為細(xì)胞等。Moxi GO II根據(jù)庫(kù)爾特原理，采用的是3D立體測(cè)量，獲得更為真實(shí)的細(xì)胞大小信息，提供高分辨率的細(xì)胞粒徑分布圖。如圖4所示，將5種不同大小的微珠（4.1μm，6μm，7.9μm，10.1μm，和 16μm）混樣，分別用Moxi GO II和成像類細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Moxi GO II能夠很好的區(qū)分5個(gè)峰，而成像類設(shè)備只能區(qū)分兩個(gè)峰，前面的4個(gè)峰無(wú)法區(qū)分開(kāi)來(lái)（圖4紅框內(nèi)）。
高分辨率的直方圖結(jié)果，也可用于評(píng)估細(xì)胞樣本的聚集程度，研究者可據(jù)此評(píng)估是否需要在后續(xù)操作之前對(duì)樣本進(jìn)行調(diào)整。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)要求樣本為單細(xì)胞懸液，以確保每個(gè)油滴中僅捕獲一個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞聚集狀態(tài)會(huì)對(duì)下游實(shí)驗(yàn)造成重要影響。如圖6所示，在Moxi GO II系統(tǒng)中，將聚集的HEK-293細(xì)胞結(jié)果直方圖（灰色曲線）與單分散的單細(xì)胞樣本結(jié)果直方圖（綠色曲線）疊加比較，發(fā)現(xiàn)灰色曲線不僅峰值分布的偏斜（長(zhǎng)尾）的顯著增加，而且還顯示了模態(tài)峰值的增加，因?yàn)闃颖局饕�由多峰（�?xì)胞簇）組成。

• 樣品純度評(píng)估指標(biāo)

在單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)樣本制備過(guò)程中，關(guān)鍵部分是將單個(gè)細(xì)胞包裹進(jìn)油包水的微液滴中。
因此，當(dāng)研究人員研究特定類型細(xì)胞時(shí)，盡可能最大限度提高含有該類型細(xì)胞的液滴比例。Moxi GO II可通過(guò)粒徑和熒光測(cè)量來(lái)評(píng)估樣品純度，如圖7所示。圖中紅色直方圖是粒徑分布圖疊加。研究者可通過(guò)粒徑門(mén)控計(jì)算RBC“污染”程度（黃色箭頭所指為RBC峰），還可通過(guò)熒光標(biāo)記，進(jìn)行第二維度的純度檢測(cè)（黃色框內(nèi)是通過(guò)PE-CD45（HI30）抗體標(biāo)記的白細(xì)胞）。

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)常用磁珠來(lái)純化細(xì)胞。圖8展示了初始PBMC樣本（灰色曲線）與磁珠分離后的單核細(xì)胞（綠色曲線）粒徑直方圖比較，分離后，去掉了較小的淋巴細(xì)胞峰。Moxi GO II高分辨率粒徑測(cè)量為研究者帶了便利，可通過(guò)無(wú)標(biāo)記的粒徑分布來(lái)驗(yàn)證樣品純度。

• 精確的細(xì)胞核計(jì)數(shù)

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)中，當(dāng)樣本為細(xì)胞核，需要對(duì)其進(jìn)行精確計(jì)數(shù)和測(cè)量。由于細(xì)胞核體積較�。ㄖ睆酵ǔ�為4-9μm），成像類細(xì)胞計(jì)數(shù)儀難以提供可靠的結(jié)果。而Moxi GO II可分辨低至3μm的顆粒，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行快速可靠的計(jì)數(shù)。同時(shí)，還可通過(guò)PI染色，增加細(xì)胞核分辨率。如圖9所示，圖9a為完整PBMC細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果（活率vs粒徑散點(diǎn)圖），圖9b為裂解后細(xì)胞核檢測(cè)結(jié)果，計(jì)數(shù)結(jié)果相同（1.23e5/ml）。分離的細(xì)胞核樣本粒徑減少，熒光信號(hào)增強(qiáng)，符合預(yù)期。

• 細(xì)胞表型分析

單細(xì)胞測(cè)序中，使用細(xì)胞表面免疫標(biāo)記進(jìn)行表型分析，即用于基因組分析之前簡(jiǎn)單地確認(rèn)或鑒定細(xì)胞組成（例如，PBMC樣品中CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的百分比），也可以用于樣品純度檢測(cè)（例如，在T細(xì)胞分選或磁珠分離后使用CD3來(lái)確定T細(xì)胞純度）。Moxi GO II具有488nm激光器和兩個(gè)PMT，可同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)熒光團(tuán)（例如FITC和PE），進(jìn)行精確的計(jì)數(shù)和粒徑測(cè)量。如圖10所示，具有FITC抗人CD8（HIT8a，BioLegend）和PE抗人CD3（OKT3，BioLegend）的雙重標(biāo)記。使用Moxi GO II象限門(mén)控可輕松圈定陽(yáng)性與陰性群體的熒光，使研究人員能夠區(qū)分細(xì)胞群體。對(duì)于分選后的純度檢測(cè)，第一PMT/通道（525/45nm）可用于純化細(xì)胞的獨(dú)特抗體標(biāo)記。第二通道646nm/LP可用于測(cè)量PI染色（活率）。通過(guò)這種設(shè)置，研究者一次測(cè)試，可獲得了多個(gè)質(zhì)控信息：表型純度、尺寸分布（例如聚類）、濃度和活力。
總結(jié)：
單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)獨(dú)特復(fù)雜，成本昂貴，因此樣本處理制備就顯得尤為重要，是下游實(shí)驗(yàn)成敗的基礎(chǔ)。Orflo的Moxi GO II系統(tǒng)非常適用于細(xì)胞樣本的全程監(jiān)測(cè)。 Moxi GO II采用庫(kù)爾特原理進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和粒徑測(cè)量，同時(shí)采用488nm激光光源，結(jié)合兩個(gè)PMT通道，525/45nm通道和561nm/LP（或者646nm/LP，可根據(jù)需要更換），進(jìn)行細(xì)胞活率、細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)染效率、活性氧簇、線粒體膜電位等常規(guī)流式檢測(cè)。
 

PMT 通道	兼容染料（包括但不限于）
525/45nm通道	Annexin V-FITC， Alexa Fluor? 488， BB515，GFP， Calcein等
561nm/LP通道	PE，PI，RFP等
646nm/LP通道	PI，7-AAD等

儀器設(shè)計(jì)小巧輕便，無(wú)需預(yù)熱，開(kāi)機(jī)即用，預(yù)設(shè)程序，觸屏操控，運(yùn)行后10秒即可給出測(cè)試結(jié)果，使用后也無(wú)需清潔維護(hù)。Moxi GO II功能多樣，簡(jiǎn)單易用，為廣大研究者提供了一個(gè)非常實(shí)用的檢測(cè)工具。通過(guò)Moxi GO II，無(wú)論是經(jīng)驗(yàn)豐富的流式專家，還是初試身手的實(shí)驗(yàn)小白，都可以輕松完成實(shí)驗(yàn)。

美國(guó)Orflo Technologies公司是一家非常專業(yè)的細(xì)胞分析儀器研發(fā)和制造企業(yè)，擁有多項(xiàng)專利技術(shù)，產(chǎn)品以庫(kù)爾特原理的高精細(xì)胞計(jì)數(shù)儀和超快流式細(xì)胞儀為主。作為中國(guó)地區(qū)獨(dú)家代理，環(huán)亞生物科技有限公司全權(quán)負(fù)責(zé)Orflo Technologies產(chǎn)品在中國(guó)地區(qū)的推廣、銷售，為廣大用戶提供專業(yè)的技術(shù)咨詢和產(chǎn)品服務(wù)。

環(huán)亞生物，生命科學(xué)產(chǎn)品全國(guó)性代理商，不斷把國(guó)外頂級(jí)的創(chuàng)新產(chǎn)品引入中國(guó)。環(huán)亞生物具備完善的公司運(yùn)營(yíng)、產(chǎn)品管理、營(yíng)銷、售前技術(shù)支持和售后維修體系。

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