Nature文獻解析：代謝組學技術助力揭示鳥氨酸轉氨酶胰腺癌新靶點

胰腺導管腺癌（PDA）是一種高致死性的惡性腫瘤，其發(fā)病率不斷上升，預后不佳，急需開發(fā)有效的治療PDA的方法。十多年來盡管針對腫瘤代謝的治療一直是研究的重點，但PDA腫瘤代謝的可塑性和潛在毒性限制了這種治療策略。近期來自美國波士頓兒童醫(yī)院的Nada Y. Kalaany 團隊利用¹⁵N谷氨酰胺同位素示蹤及代謝組學技術揭示胰腺癌細胞通過鳥氨酸轉氨酶（OAT）促進多胺合成進而促進腫瘤生長的重要機制，使用OAT抑制劑可有效抑制胰腺癌細胞增殖，相關研究成果發(fā)表于Nature。
 

PDA通過谷氨酰胺生成多胺

作者之前的研究發(fā)現，谷氨酰胺氨基上的氮被直接輸送到獨立于尿素循環(huán)的鳥氨酸的從頭合成（DNS）。這種OAT催化的可逆反應主要限于嬰兒早期的鳥氨酸和精氨酸合成。相比之下，大多數成年人的組織傾向于相反的方向，降解鳥氨酸以生成谷氨酸。在成人中，鳥氨酸通常是通過精氨酸酶（ARG1和ARG2）從精氨酸中產生的，既可作為尿素循環(huán)中瓜氨酸合成的底物，也可作為多胺類物質的前體，包括腐胺、亞精胺和精胺。這些分子參與了細胞生長和生存的多個基本過程。那么在PDA中，谷氨酰胺衍生的而非精氨酸衍生的鳥氨酸，是否作可作為一個特殊的多胺來源呢？

首先，通過同位素示蹤法用¹⁵N谷氨酰胺培養(yǎng)人AsPC-1細胞，結果顯示，谷氨酰胺的氮未轉移到瓜氨酸、精氨酸、精氨酸或尿素中；相反，檢測到其轉移到鳥氨酸中，表明DNS的發(fā)生，因為即使尿素循環(huán)是活躍的，這種氮也會被傳遞給尿素而非鳥氨酸，使得DNS成為其轉移到鳥氨酸的唯一途徑。谷氨酰胺而非精氨酸被證明是PDA癌細胞系的鳥氨酸及其多胺衍生物腐胺的主要來源。與PDA癌細胞系不同，在人類胰腺導管上皮細胞（HPDE）和所有測試的非PDA癌細胞系中，精氨酸是鳥氨酸和腐胺的主要來源，其中高達87%的鳥氨酸和80%的腐胺來自¹⁵N-Arg，而只有40%的鳥氨酸和41%的腐胺酸來自¹⁵N-Gln。相比之下，所有PDA細胞系，除了非KRAS驅動的BxPC3細胞系，都更偏好谷氨酰胺：從¹⁵N-Gln中得到的鳥氨酸和腐胺高達71%，而從¹⁵N-Arg中得到的鳥氨酸和腐胺為35%。這些結果將PDA（其中90%以上的病例由KRAS驅動）與正常胰腺細胞和其他癌癥類型區(qū)分開來，因為它使用谷氨酰胺而非精氨酸作為多胺合成的來源，且這一特征既不是來源于谷氨酰胺分解增強也不是由于其增殖增強。

隨后探究其體內變化，給多西環(huán)素誘導的PDA小鼠模型（iKras^G12D）和無腫瘤對照組（iKras^WT）注入¹⁵N-Gln或¹⁵N-Arg。在所有小鼠中，在3小時內正常胰腺和腫瘤中分別達到約54%的¹⁵N-Gln和30-40%的¹⁵N-Arg的富集。且與正常胰腺組相比，PDA腫瘤中¹⁵N-Gln衍生的鳥氨酸和腐胺的合成率及其總量都顯著升高。其中，PDA中谷氨酰胺分別占鳥氨酸標記和腐胺標記部分的45%和23%，而在正常胰腺中分別占19%和3%。相比之下，精氨酸是正常胰腺組中鳥氨酸（51%）和腐胺（16%）的主要貢獻者，而PDA中只有14%的鳥氨酸和6%的腐胺來自精氨酸。這表明，與正常組織相比，PDA在體內多胺合成中主要使用谷氨酸而非精氨酸（圖1）。

PDA的腫瘤微環(huán)境中精氨酸被耗竭
是什么原因導致了PDA傾向于利用谷氨酸合成多胺？研究者分別從iKras^G12D和iKras^WT小鼠中分離出胰腺或腫瘤間質液和血漿進行代謝組學分析，結果表明，血漿中的代謝物組成與是否患有腫瘤無關；且血漿代謝物含量與腫瘤間質液（TIF）的代謝物含量不相關，在正常胰腺間質液（NIF）和腫瘤間質液（TIF）之間存在顯著差異。因此，與胰腺癌相關的代謝差異主要發(fā)生在TME（腫瘤微環(huán)境）內，而非血漿中。且與血漿相比，對照組小鼠的NIF中精氨酸水平都較低，這表明它們被胰腺和/或其微環(huán)境所利用。然而，只有精氨酸及其尿素循環(huán)前體瓜氨酸在TIF中被進一步耗竭，而谷氨酰胺的水平仍與血漿中的相似。最近發(fā)現，這種精氨酸的耗竭是由PDA的 TME中表達ARG1的骨髓細胞分解精氨酸所致，這進一步促進PDA細胞代償性地重新合成精氨酸。因此，KRAS驅動的PDA細胞能夠在完全沒有精氨酸或含有與TIF相當水平的培養(yǎng)基中生存和增殖，盡管速度很慢。根據精氨酸在體內的低可利用性，推測PDA重新調整其代謝，以有利于其獨特地使用谷氨酰胺進行多胺合成�？傊�，PDA細胞對谷氨酰胺合成具有獨特使用性以適應其精氨酸缺乏的微環(huán)境（圖1）。

圖1. PDA利用谷氨酰胺進行DNS和多胺的合成

PDA依賴于DNS

盡管人類胰腺組織中調控鳥氨酸從頭合成（DNS）的OAT的mRNA水平在顯著低于其他組織，但與正常胰腺相比，在PDA腫瘤中的OAT的mRNA和蛋白水平均增加。鳥氨酸除了通過OAT從谷氨酰胺產生，或通過ARG從精氨酸產生之外，還可以通過肌酸合成途徑中的甘氨酸脒基轉移酶（GATM）從精氨酸產生。

為了評估它們對多胺合成和腫瘤生長的不同貢獻，在AsPC-1細胞中分別敲除三種鳥氨酸合成酶，并與敲除多胺合成的限速酶ODC1進行比較。選擇ARG2而不是ARG1是因為ARG1在PDA細胞中的表達水平無法檢測。結果顯示，與ODC1相似，當敲除OAT而非ARG2或GATM后，才能抑制¹⁵N-Gln衍生的鳥氨酸和腐胺的合成。雖然敲除OAT后觀察到¹⁵N-Arg衍生的鳥氨酸增加，但總的鳥氨酸水平并沒有代償性增加，也未影響腐胺的水平，表明對DNS的抑制不會導致PDA中精氨酸衍生的鳥氨酸或多胺合成的代償性增加。相比之下，ODC1敲除導致其底物鳥氨酸的積累，并使OAT反應向鳥氨酸降解逆轉；這又導致通過ARG2合成鳥氨酸（M+2）和尿素（M+2）以及通過GATM產生肌酸和肌酐（M+2）的¹⁵N-Arg衍生的合成代償性增加。隨后，¹⁵N-Arg衍生的鳥氨酸被引向谷氨酸（M+1）和脯氨酸（M+1）的合成。因此，盡管ODC1或OAT的敲除同樣抑制了多胺的合成，但敲除ODC1而非OAT可以代償性地誘導精氨酸介導的鳥氨酸合成。敲除OAT而非ARG2或GATM，在抑制AsPC-1細胞增殖方面與敲除ODC1一致；且補充腐胺后，該抑制作用得到逆轉，這表明，OAT是PDA細胞生長所必需的，而OAT介導的腐胺合成是生長維持的主要貢獻者。

在胰腺正常導管上皮細胞中，敲除OAT抑制¹⁵N-Gln衍生的鳥氨酸和腐胺酸的低水平，同時誘導¹⁵N-Arg合成的代償性增加；這反過來又導致了鳥氨酸和腐胺酸總庫的增加，但不影響增殖。這些數據與PDA中敲除OAT的影響相反，在PDA中未觀察到精氨酸衍生的鳥氨酸或腐胺酸的顯著代償性增加，且PDA細胞增殖顯著減少，這揭示了OAT在胰腺癌細胞而非正常細胞中的關鍵作用以及其作為治療靶標的潛力。

進一步探究PDA中對DNS的體內需求，監(jiān)測來自人類PDA細胞的正位異種移植的生長，其中OAT或ODC1被敲除。結果顯示，敲除OAT或ODC1抑制PDA的生長，在4周內均顯著減小腫瘤大小。與體外結果一致，¹⁵N-Gln注入腫瘤小鼠體內后，在移植的Oat基因敲除（KO）腫瘤中，¹⁵N標記的鳥氨酸和腐胺水平都降低，表明DNS和多胺的合成都受到影響；但在Odc1基因敲除的腫瘤中，只有腐胺水平降低。總之，存在于TME中的多胺大多來自于PDA細胞，而不是非癌細胞，從而為通過抑制OAT來特異性和有效地靶向PDA提供治療窗口（圖2）。

圖2. OAT是PDA多胺合成和腫瘤生長的必要條件

KRAS驅動PDA的多胺合成
90%的胰腺癌中存在原癌基因KRAS突變，并促進腫瘤發(fā)生和發(fā)展。而在非KRAS突變的胰腺癌細胞系BxPC-3，其主要依賴于精氨酸用于多胺的合成，于是探究KRAS對DNS和多胺合成的調控作用。對多西環(huán)素誘導的iKras細胞系的分析表明，Kras^G12D抑制¹⁵N-Gln衍生的鳥氨酸和腐胺水平，而¹⁵N-Arg衍生的鳥氨酸和腐胺水平無影響，這導致總鳥氨酸和腐胺減少；通過¹⁵N-谷氨酸歸一化后依然如此，表明它的產生不是由于谷氨酸分解的增強。此外，Kras^G12D在小鼠PDA細胞或其在人類PDA細胞中的敲除導致OAT、ODC1以及精氨酸合成和精氨酸合成酶SRM和SMS的mRNA和蛋白水平均下降，但不影響ARG2。這一現象被KRAS效應因子MEK的抑制劑（抑制劑AZD6244）所重現，而 PI3K（BKM120）、AKT（MK2206）或mTORC1（雷帕霉素）的抑制劑則不能重現，表明在PDA中KRAS-MEK軸調控鳥氨酸和多胺合成。

對PDA中所有四個關鍵的多胺合成基因（OAT、ODC1、SRM和SMS）共有的轉錄因子進行搜索，發(fā)現有六個在人類和小鼠之間保守的潛在候選基因位于OAT的轉錄起始位點附近：ZBTB14、SP1、KLF6、GTF2IRD1、CHURCH1和EGR1。進一步實驗發(fā)現，沉默Klf6，但不沉默其他轉錄因子，顯著下調Oat、Odc1、Srm和Sms的表達，但不影響Arg2；且在Kras^G12D敲除后逆轉，表明KLF6是Kras^G12D的下游效應器。且敲除KLF6后抑制谷氨酰胺衍生而非精氨酸衍生的鳥氨酸或腐胺水平。因此，KLF6是KRAS驅動的DNS和多胺合成的轉錄上調中的一個關鍵因子（圖3）。
 

圖3. KRAS促進PDA中DNS和多胺的合成
 

抑制OAT可緩解PDA進展
既然PDA依賴于OAT將谷氨酰胺轉化為鳥氨酸，并通過ODC1將鳥氨酸轉化為腐胺進而變成多胺以促進腫瘤生長，那么干預該代謝途徑是否可以緩解PDA進展？研究者分別采用ODC1抑制劑（二氟甲基鳥嘌呤，DFMO）以及OAT抑制劑（5-氟甲基鳥嘌呤，5-FMO）進行比較。結果顯示，用5-FMO處理人或小鼠PDA細胞時，顯著抑制谷氨酸衍生的鳥氨酸和腐胺的合成，并有效地抑制PDA腫瘤細胞的增殖，且這一過程在乳腺癌細胞系中無法復現，表明5-FMO對胰腺癌細胞的特異性；而ODC1抑制劑DFMO的處理盡管表現出有效地抑制腫瘤細胞增殖的效果，但是其對非腫瘤細胞的抑制效果仍十分明顯，表明DFMO不加區(qū)分地影響癌細胞和非癌細胞，存在潛在的毒性。

在體內，用5-FMO處理引起iKras小鼠對PDA的顯著和劑量依賴性的抑制，這種影響伴隨著鳥氨酸和腐胺合成的幾乎完全被抑制，且身體未呈現消瘦及肝毒性。多胺類物質可以改變TME中的免疫群體，誘發(fā)對抗腫瘤免疫的逃避，于是探究其對TME的影響。在正位iKras PDA腫瘤中敲除Oat或Odc1并不改變CD8⁺T細胞的比例，但導致了CD4⁺T細胞顯著增加。免疫抑制性粒細胞——骨髓源性抑制細胞的數量也有所減少，這與腫瘤較小及TME中多胺減少相一致。然而，這不太可能是多胺合成下降的主要抗腫瘤機制，因為在免疫缺陷小鼠中，人源腫瘤細胞中敲除OAT或ODC1仍能顯著降低小鼠的腫瘤負荷（圖4）。

OAT介導PDA的基因組及表觀遺傳改變
多胺可以影響轉錄、翻譯和染色質結構，并從表觀調控免疫細胞的激活和功能。然而，多胺如何改變癌細胞，特別是PDA的表觀調控尚不清楚。對表達或敲除ODC1、OAT或ARG2的人類AsPC-1 PDA細胞進行轉錄組學檢測，評估谷氨酸衍生的多胺與精氨酸衍生的多胺對PDA的轉錄改變的不同影響。結果顯示，敲除OAT或ODC1的細胞共有的差異表達基因的數量大約是敲除ARG2或ODC1的細胞的兩倍。聚類分析表明，ODC1敲除的差異表達基因與OAT敲除的細胞的轉錄變化的相似性高于ARG2敲除的細胞，后者與對照組更相似。ODC1是多胺合成的主要限速酶， OAT在為多胺合成提供鳥氨酸方面比ARG2有更大的貢獻，且OAT的抑制對多胺誘導的轉錄變化有重大影響。

對PDA細胞進行轉座酶可接觸染色質的高通量篩選（ATAC-seq）檢測，結果顯示，敲除ODC1后，染色質可及性發(fā)生顯著的變化，重點關注敲除ODC1和OAT后持有一致的共同變化的最大的差異表達基因簇（簇I，561個基因和簇V，403個基因），發(fā)現敲除ODC1和OAT而非ARG2，mRNA水平降低與簇I中染色質通路的減少一致；簇V中也是如此，這表明，OAT而非ARG2在多胺驅動的染色質通路改變中的作用，這些改變對應于基因表達的顯著變化。對敲除ODC1的PDA細胞中所有2698個差異表達的基因進行基因組富集分析（GSEA），確定了前18個下調通路，涉及122個與細胞增殖、分化、對生長因子的反應、細胞因子和對饑餓的反應有關的基因，與敲除OAT或ODC1后的腫瘤生長抑制一致；且在補充腐胺后，從該組中隨機選擇的樣本（7個基因）的表達得到恢復，進一步支持了OAT而非ARG2在多胺驅動的與PDA生長有關的轉錄和表觀遺傳學變化中的重要作用（圖4）。
 

圖4. 抑制OAT可緩解PDA并改變其轉錄和表觀遺傳

小結
本研究在人類和小鼠的體外和體內模型中使用利用¹⁵N谷氨酰胺同位素示蹤及代謝組、基因敲除和抑制劑等方法，表明PDA對谷氨酰胺衍生的鳥氨酸合成有顯著的依賴性。這一過程是通過OAT介導，它支持多胺的合成，是腫瘤生長所必需的。這種依賴性與PDA腫瘤微環(huán)境中的精氨酸耗竭有關，并且是由突變的KRAS驅動。激活的KRAS誘導OAT和多胺合成酶的表達，導致PDA腫瘤細胞的轉錄組和表觀遺傳的改變。PDA組織（而非正常組織）對OAT介導的從頭合成鳥氨酸的獨特依賴性，為OAT抑制劑治療胰腺癌提供了一種具體而有效的策略，而且毒性最小。

參考文獻
Ornithine aminotransferase supports polyamine synthesis in pancreatic cancer. Nature. 2023.

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繪譜幫你測
本研究利用同位素示蹤及代謝組、基因敲除和抑制劑等方法，揭示胰腺癌細胞通過鳥氨酸轉氨酶（OAT）促進多胺合成，進而促進腫瘤生長的重要機制。其中¹⁵N谷氨酰胺等代謝流分析，常規(guī)靶向和非靶向代謝組，腐胺，精胺，亞精胺，精氨酸，鳥氨酸的絕對定量麥特繪譜均可檢測。本公司經典的已獲得客戶高度肯定的Q300全定量檢測技術和升級的新品Q1000技術，均可精確捕捉到論文中提到的代謝途徑中所有小分子產物的細微改變。目前Q300技術已助力客戶在Science, Cell Metabolism, Gut, Advanced Science, Diabetes Care, Nature Communications, PNAS等權威期刊發(fā)表近60篇SCI文章，平均IF>10分。

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