納米孔測(cè)序儀在線粒體DNA控制區(qū)異質(zhì)性檢測(cè)分析全流程中的應(yīng)用

近日，四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)學(xué)院的侯一平教授團(tuán)隊(duì)基于國(guó)產(chǎn)QNome納米孔測(cè)序平臺(tái)，在法醫(yī)遺傳學(xué)的TOP期刊Forensic Science International: Genetics上在線發(fā)表題為《CmVCall: an automated and adjustable nanopore analysis pipeline for heteroplasmy detection of the control region in human mitochondrial genome》的研究成果。  
研究團(tuán)隊(duì)基于齊碳科技納米孔QNome測(cè)序平臺(tái)自主開(kāi)發(fā)了mtDNA控制區(qū)異質(zhì)性檢測(cè)分析全流程—CmVCall，研究結(jié)果表明齊碳QNome平臺(tái)對(duì)線粒體控制區(qū)序列識(shí)別具有簡(jiǎn)便性和適用性。
 
此研究為納米孔基因測(cè)序技術(shù)常規(guī)應(yīng)用于線粒體基因組奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，也進(jìn)一步拓展了齊碳科技納米孔測(cè)序平臺(tái)的應(yīng)用場(chǎng)景。
 
背景
線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）是真核生物中獨(dú)立于核基因組之外的遺傳物質(zhì)，呈閉環(huán)雙鏈結(jié)構(gòu)，具有母系遺傳、多拷貝、異質(zhì)性閾值效應(yīng)及變異率較高等特點(diǎn)。由于mtDNA 特殊的遺傳特征和環(huán)狀分子結(jié)構(gòu)，mtDNA檢測(cè)分析在法醫(yī)學(xué)、群體遺傳學(xué)、人類生態(tài)學(xué)、分子進(jìn)化和考古學(xué)有重要的應(yīng)用意義。
 
mtDNA序列及異質(zhì)性分析在很大程度上依賴于測(cè)序技術(shù)。Sanger測(cè)序由于流程相對(duì)繁瑣、分辨率較低、通量不足；在mtDNA異質(zhì)性應(yīng)用中往往受限。下一代測(cè)序技術(shù)（NGS）本質(zhì)為短讀長(zhǎng)測(cè)序，分析mtDNA需要拼接多個(gè)短片段擴(kuò)增子，擴(kuò)增效率對(duì)異質(zhì)性比例的識(shí)別存在潛在影響。此外，短片段擴(kuò)增的非特異性容易受到核線粒體DNA（nuclear mitochondrial DNA，NUMT）序列的影響，從而使mtDNA分析變得復(fù)雜。
 
作為最新一代基因測(cè)序技術(shù)，納米孔測(cè)序可利用其讀長(zhǎng)長(zhǎng)、實(shí)時(shí)測(cè)序的天然優(yōu)勢(shì)改善或避免以上限制，為異質(zhì)性檢測(cè)提供全新的方法和見(jiàn)解。目前，納米孔測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用已在多個(gè)臨床和生物學(xué)領(lǐng)域得到了開(kāi)發(fā)，然而，利用該技術(shù)進(jìn)行mtDNA異質(zhì)性檢測(cè)的研究報(bào)道卻還很少。
 
作為國(guó)內(nèi)首家自主研發(fā)納米孔基因測(cè)序技術(shù)的齊碳科技，QNome平臺(tái)已被應(yīng)用于各種生物學(xué)研究，平臺(tái)在微單倍型遺傳標(biāo)記的分型研究結(jié)果已發(fā)表于Forensic Science International: Genetics (2022, 57, 102657)，其法醫(yī)適用性也得到了初步證實(shí)。（點(diǎn)擊此處即可跳轉(zhuǎn)閱讀原文）
 
此次，侯一平教授團(tuán)隊(duì)基于齊碳QNome平臺(tái)，進(jìn)一步開(kāi)展納米孔基因測(cè)序技術(shù)在線粒體基因組研究的應(yīng)用探索，以期改善傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)帶來(lái)的局限性，獲得更高準(zhǔn)確性的檢測(cè)結(jié)果。
 
成果概述
研究團(tuán)隊(duì)首先評(píng)估了四種常用的variant callers在人類mtDNA控制區(qū)異質(zhì)性認(rèn)證中的性能，基于模擬混合兩個(gè)合成序列( rCRS 和SSHS)樣本的QNome納米孔測(cè)序reads產(chǎn)生的不同比例（50:50, 75:25, 80:20, 85:15, 90:10, 95:5）的混合樣本。
 
隨后，基于QNome測(cè)序平臺(tái)自主開(kāi)發(fā)了mtDNA控制區(qū)異質(zhì)性檢測(cè)分析框架—CmVCall，該工具整合了多個(gè)數(shù)據(jù)處理程序，可執(zhí)行讀取過(guò)濾、去除核線粒體序列（numt）、比對(duì)、可選擇的“校正”模式和最終的異質(zhì)性識(shí)別，并驗(yàn)證了其在低異質(zhì)性水平上的表現(xiàn)。
   
同卵雙胞胎（MZ）由于特殊的胚胎發(fā)生機(jī)制，具有極其相似的遺傳特征。從早期的遺傳“共識(shí)（一致性）”角度來(lái)看，他們的遺傳信息甚至是完全一樣的，無(wú)法通過(guò)常規(guī)的法庭科學(xué)DNA檢測(cè)手段來(lái)區(qū)分，也對(duì)法醫(yī)調(diào)查提出了挑戰(zhàn)。在本研究中，為了探究納米孔測(cè)序技術(shù)在雙胞胎線粒體異質(zhì)性識(shí)別中的潛力，研究團(tuán)隊(duì)還使用來(lái)自同卵雙胞胎（MZ）的血液、唾液和毛發(fā)樣本進(jìn)行異質(zhì)性檢測(cè)評(píng)估，并與NGS平臺(tái)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。
 
成果亮點(diǎn)
1.納米孔測(cè)序結(jié)果表明CmVCall具有很高的準(zhǔn)確性，可用于納米孔測(cè)序數(shù)據(jù)mtDNA控制區(qū)的異質(zhì)性檢測(cè)。使用“無(wú)校正”選項(xiàng)，pipeline可以檢測(cè)到低至10%的異質(zhì)性水平，而使用“校正”選項(xiàng)，可以準(zhǔn)確識(shí)別5%的低頻異質(zhì)性位點(diǎn)，精度、準(zhǔn)確性和召回率分別為100%、99.9%和92.3%。  
2. 人類線粒體基因組中多聚物（homopolymer）區(qū)域的分析一直是生物信息分析學(xué)研究中的一個(gè)挑戰(zhàn)。以往的研究在檢測(cè)異質(zhì)性時(shí)，通常會(huì)丟棄這些區(qū)域。為了減少這些區(qū)域的錯(cuò)誤率，測(cè)序生化體系和分析工具均在不斷改進(jìn)中。本研究中，通過(guò)納米孔測(cè)序結(jié)合pipeline工具的嚴(yán)格過(guò)濾，避免了數(shù)據(jù)分析過(guò)程中不必要的“丟棄”，從而獲得更高水平的個(gè)體間和個(gè)體內(nèi)多態(tài)位點(diǎn)。
將QNome平臺(tái)和Ion Torrent 平臺(tái)產(chǎn)生的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示，兩個(gè)平臺(tái)的異質(zhì)性調(diào)用呈現(xiàn)一定程度的一致性。納米孔測(cè)序基于“校正”模式可以比NGS平臺(tái)識(shí)別出更多的異質(zhì)性，并在具有高覆蓋率的多聚物區(qū)域也識(shí)別出異質(zhì)性位點(diǎn)，顯示出納米孔測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用潛力。  
3.研究團(tuán)隊(duì)統(tǒng)計(jì)了每對(duì)雙胞胎三種類型樣本之間的mtDNA控制區(qū)微小差異。結(jié)果表明基于NGS數(shù)據(jù)，四對(duì)MZ雙胞胎的兩個(gè)體可以通過(guò)毛發(fā)樣本的異質(zhì)性位點(diǎn)被區(qū)分開(kāi)來(lái)，而基于QNome校正數(shù)據(jù)，雙胞胎樣本的三種樣本類型的mtDNA控制區(qū)檢測(cè)出更多的異質(zhì)性，可以區(qū)分全部7對(duì)雙胞胎樣本中的兩個(gè)體。  
結(jié)語(yǔ)
綜上所述，CmVCall具有很高的準(zhǔn)確性，并且適合用于利用納米孔測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行mtDNA控制區(qū)的異質(zhì)性檢測(cè)。在“校正”選項(xiàng)下，5%水平異質(zhì)性的精度、準(zhǔn)確性和召回率分別為100%、99.9%和92.3%。在使用MZ樣本的驗(yàn)證和比較中，結(jié)果表明，CmVCall可以比NGS能夠識(shí)別到更多的異質(zhì)性位點(diǎn)，揭示了個(gè)體間和個(gè)體內(nèi)mtDNA細(xì)微差別。同時(shí)，該研究還鑒定了一些具有極高覆蓋率和可信度的homopolymer異質(zhì)性位點(diǎn)，這意味著利用納米孔測(cè)序和CmVCall檢測(cè)這些區(qū)域的異質(zhì)性具有潛力。
研究團(tuán)隊(duì)表示，針對(duì)homopolymer區(qū)域的額外驗(yàn)證方法和新工具的不斷開(kāi)發(fā)仍然是非常必要的。此次研究的調(diào)查樣本量仍然較小，預(yù)計(jì)將基于齊碳納米孔測(cè)序技術(shù)繼續(xù)使用CmVCall分析更多類型的數(shù)據(jù)集和更大的樣本量以進(jìn)一步進(jìn)行估計(jì)和改進(jìn)，相信這一工具將為未來(lái)開(kāi)發(fā)針對(duì)線粒體全基因組的納米孔測(cè)序pipeline奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

作為國(guó)內(nèi)第一家全面掌握納米孔測(cè)序技術(shù)并將之推向商業(yè)化的企業(yè)，齊碳持續(xù)技術(shù)研發(fā)、擴(kuò)充產(chǎn)品矩陣，不斷解鎖更多應(yīng)用場(chǎng)景，讓這項(xiàng)高精尖的技術(shù)產(chǎn)生更多的現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)力。
目前，已經(jīng)形成了以基因測(cè)序儀為核心，配套有試劑、芯片及軟件的測(cè)序平臺(tái)。此外還有實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化、生信分析等應(yīng)用支撐產(chǎn)品，形成了完整的基因測(cè)序全鏈條解決方案。
今年3月，齊碳重磅發(fā)布了全新迭代升級(jí)的K2體系，帶來(lái)了更準(zhǔn)、更穩(wěn)、更高效的測(cè)序體驗(yàn)。單次準(zhǔn)確率從90%躍升至97%，Consensus 準(zhǔn)確率（70x）從Q40提升至Q50，不僅 Homopolymer 分辨能力大幅提升，還實(shí)現(xiàn)了高精度短序列測(cè)序，同時(shí)上樣量也大幅減少。
8月18日，齊碳時(shí)隔一年再發(fā)新品，重磅推出自主研發(fā)的中通量納米孔基因測(cè)序平臺(tái)QPursue，從低通量QNome測(cè)序平臺(tái)擴(kuò)展到中通量測(cè)序平臺(tái)QPursue，不僅展現(xiàn)了齊碳強(qiáng)勁的研發(fā)實(shí)力和創(chuàng)新能力，也代表著國(guó)內(nèi)納米孔基因測(cè)序技術(shù)的最前沿水平。
未來(lái)，齊碳科技將持續(xù)深耕，不斷提升測(cè)序性能、降低測(cè)序成本，充分挖掘納米孔測(cè)序技術(shù)的優(yōu)勢(shì)潛能，推動(dòng)納米孔測(cè)序技術(shù)迭代和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，加速納米孔基因測(cè)序儀國(guó)產(chǎn)化時(shí)代進(jìn)程！
 
特別鳴謝四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)學(xué)院的侯一平教授團(tuán)隊(duì)對(duì)本文的指導(dǎo)！

參考文獻(xiàn)：
[1]Lirong Jiang, Jing Liu,Suyu Li,et,al. CmVCall: an automated and adjustable nanopore analysis pipeline for heteroplasmy detection of the control region in human mitochondrial genome.Forensic Science International: Genetics.Volume 67, November 2023, 102930.

2021年12月，齊碳科技通過(guò)5年的自主研發(fā)，成功推出國(guó)內(nèi)首臺(tái)商業(yè)化的納米孔基因測(cè)序儀QNome-3841，并宣布首個(gè)生產(chǎn)基地竣工，正式開(kāi)啟納米孔基因測(cè)序國(guó)產(chǎn)化時(shí)代。2022年6月，齊碳科技發(fā)布納米孔基因測(cè)序儀QNome-3841hex，標(biāo)志著國(guó)產(chǎn)納米孔基因測(cè)序儀開(kāi)始了矩陣化發(fā)展，這也為靈活測(cè)序場(chǎng)景提供全新的解決方案，將更好地滿足市場(chǎng)應(yīng)用的多元需求。