分子克隆技術(shù)的研究應(yīng)用領(lǐng)域及實驗步驟

一、概念

分子克隆技術(shù)是一種在分子水平上操作的技術(shù)，用于將特定的DNA片段從供體生物中分離出來，然后通過體外重組、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等方法，將其插入到適合的克隆載體中，并將重組克隆載體引入到合適的寄主體內(nèi)進行復(fù)制與擴增。最終通過篩選、分離出所需的目的克隆載體，得到多拷貝的目的DNA，從而實現(xiàn)目的基因的擴增。

 

二、涉及研究領(lǐng)域

1. 分子克隆技術(shù)為許多研究領(lǐng)域提供了重要的方法和手段，以下是一些主要的研究領(lǐng)域：

①基因克隆和表達：分子克隆技術(shù)可以用于從供體生物中分離特定的DNA片段，然后將其插入到克隆載體中以實現(xiàn)目的基因的擴增和表達。這一技術(shù)對于研究和理解基因的功能以及開發(fā)新的基因療法和藥物至關(guān)重要。例如，可以研究基因表達產(chǎn)物的相互作用、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能等。

②病毒包裝和基因治療：通過分子克隆技術(shù)，科學(xué)家們可以創(chuàng)建含有特定病毒基因的重組載體，然后將其導(dǎo)入到宿主細胞中以產(chǎn)生病毒顆粒。這種技術(shù)被廣泛應(yīng)用于疫苗開發(fā)和基因治療。

③細胞治療和基因修飾：通過使用分子克隆技術(shù)，科學(xué)家們可以修改和修飾細胞基因組，從而改變細胞的特性和功能。這種技術(shù)對于研究疾病機制、開發(fā)新的細胞療法以及生產(chǎn)具有特定功能的細胞系具有重要的應(yīng)用價值。例如，通過CRISPR-Cas9等技術(shù)可以實現(xiàn)定點敲除、插入或替換特定基因；或者可以構(gòu)建CAR-T細胞治療腫瘤、干細胞治療脊髓損傷等。

④蛋白質(zhì)組學(xué)和生物大分子研究：分子克隆技術(shù)可用于創(chuàng)建含有特定蛋白質(zhì)或生物大分子編碼基因的重組載體，然后在宿主細胞中表達和純化這些蛋白質(zhì)或生物大分子。這種技術(shù)對于研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能以及開發(fā)新的藥物和療法具有重要意義。

⑤基因敲除和功能研究：通過使用分子克隆技術(shù)，可以創(chuàng)建含有特定基因敲除序列的重組載體，然后將它們導(dǎo)入到細胞中以刪除目標(biāo)基因。這種技術(shù)被廣泛應(yīng)用于研究基因的功能和確定特定基因在細胞生物學(xué)中的作用。例如，通過敲除小鼠或其他模式生物中的特定基因，可以研究該基因?qū)ι�長發(fā)育、代謝等方面的作用。

⑥藥物篩選和研究：利用分子克隆技術(shù)可以構(gòu)建藥物篩選模型，快速篩選出具有特定作用機制的藥物。例如，可以構(gòu)建突變體細胞系或模式生物，研究藥物的作用機制和效果。

⑦農(nóng)業(yè)和動物育種：分子克隆技術(shù)可以用于培育轉(zhuǎn)基因作物和動物，提高產(chǎn)量、抗性以及生產(chǎn)高質(zhì)量的農(nóng)產(chǎn)品。此外，分子克隆技術(shù)還可以應(yīng)用于動物育種，實現(xiàn)優(yōu)良性狀的基因組合。

 

2.應(yīng)用舉例說明

舉例一：研究人類基因功能。若想要研究某個人類基因在細胞中的功能，可以使用分子克隆技術(shù)克隆該基因，并將其插入細胞中，觀察基因表達對細胞功能的影響，從而揭示該基因的功能。

舉例二：制備重組蛋白。若需要大量的特定蛋白用于實驗或藥物研發(fā)，可以使用分子克隆技術(shù)將目標(biāo)蛋白的基因插入表達載體中，然后在宿主細胞中大量表達目標(biāo)蛋白，并進行后續(xù)的純化和功能研究。

舉例三：改良作物品質(zhì)。若想要改良某個作物的品質(zhì)，可以使用分子克隆技術(shù)克隆與目標(biāo)性狀相關(guān)的基因，并將其插入作物基因組中，從而實現(xiàn)對作物品質(zhì)的改良，例如提高作物的抗病性、產(chǎn)量和品質(zhì)。

總結(jié)起來，分子克隆技術(shù)是一項重要的分子生物學(xué)技術(shù)，通過重組DNA分子，可以制備大量相同的DNA片段。它在基因研究、蛋白表達、基因治療、農(nóng)業(yè)改良和藥物研發(fā)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。

 

三、實驗步驟

1.獲取目的基因片段：

①樣本采樣保存：為保證提取出的核酸質(zhì)量優(yōu)質(zhì)且穩(wěn)定，采樣后應(yīng)及時處理及妥善保存，以便于后續(xù)實驗的成功。

②核酸提取

核酸提取是在分子生物學(xué)實驗中從細胞或生物組織中分離并純化核酸的過程。

以下是一些常見的核酸提取方法：

☆ 酚/氯仿抽提法：通過酚/氯仿處理細胞破碎液或組織勻漿后，在水相中主要溶解的是以DNA為主的核酸成分，在有機相中主要是脂類物質(zhì)，蛋白質(zhì)則沉淀于兩相之間。離心分層后取出水層，多次重復(fù)操作，再合并含核酸的水相，利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀核酸，之后再離心分離和純化溶解即可得到高純度核酸。該法最大優(yōu)勢是成本低，對實驗條件要求較低，提取的核酸保持天然狀態(tài)，獲得的核酸純度高、片段大、效果好。缺點是操作較為繁瑣。

☆ 煮沸裂解法：適用于提取細菌質(zhì)粒DNA。但得量少，雜質(zhì)多，DNA可能會出現(xiàn)斷裂，主要適用于一些粗略的實驗。

☆ 堿裂解法：適用于提取質(zhì)粒DNA。這種方法是根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性染色體DNA在拓撲學(xué)上的差異來分離它們的。

☆ 層析柱法：通過特殊硅基質(zhì)吸附材料，能夠特定吸附DNA，而RNA和蛋白質(zhì)順利通過，然后利用高鹽低PH結(jié)合核酸，低鹽高PH值洗脫，來分離純化核酸。

☆ 熱裂解堿法：堿法提取主要是利用共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓撲學(xué)上的差異來分離他們，在堿性下，變性蛋白是可溶的。

☆ 乙醇沉淀法：乙醇能夠消除核酸的水化層，使帶負電荷的磷酸基團暴露出來，Na+等帶正電荷離子能與磷酸基團結(jié)合，形成沉淀。

☆ 核酸提取儀：應(yīng)用配套的核酸提取試劑來自動完成樣本核酸提取工作的儀器。

以上方法僅供參考，實際操作中請依據(jù)具體情況選擇。

③逆轉(zhuǎn)錄（此步驟僅限于提取的核酸為RNA時使用）

④PCR

以上內(nèi)容請參考：分子技術(shù)#1、2、3、4

⑤凝膠電泳實驗

☆ 實驗需要準(zhǔn)備材料：瓊脂糖、緩沖液、DNA樣品、DNA Marker、Loading buffer、核酸染料、核酸預(yù)制膠（若不自己配膠，可直接購買成品的預(yù)制膠）

☆ 實驗設(shè)備：燒杯、量筒、天平、加熱設(shè)備、電泳儀、電泳槽、制膠設(shè)備、移液器、吸頭、凝膠成像系統(tǒng)、電腦

☆實驗步驟

看凝膠電泳實驗的實驗視頻

 

2.載體的選擇

在分子克隆中，載體選擇是非常關(guān)鍵的一步，因為它的性質(zhì)和種類將直接影響實驗的效率和結(jié)果。根據(jù)載體的性質(zhì)和功能，可以將其分為以下幾類：

按進入受體細胞的類型分類：

原核載體：原核細胞（如大腸桿菌）可直接攝取并表達重組體中的外源基因，因此原核載體常被用于原核細胞克隆。

真核載體：真核細胞（如酵母、哺乳動物細胞等）不能直接攝取重組體中的外源基因，但可以通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染等方法將重組體導(dǎo)入細胞中并表達外源基因，因此真核載體常被用于真核細胞克隆。

穿梭載體：穿梭載體既含有原核復(fù)制子，又含有真核復(fù)制子，可以在原核和真核兩種宿主細胞中復(fù)制，并在真核細胞中有效表達。

按功能分類：

克隆載體：主要用于DNA克隆和擴增。它是一種可以接受外源DNA插入的DNA分子，通常包括質(zhì)粒、噬菌體、宇宙中介病毒（Cosmid）等。例如，pUC19就是一種常用的質(zhì)粒型克隆載體。通過將外源DNA插入到克隆載體中，然后在受體細胞內(nèi)進行復(fù)制和擴增，可以獲得大量的目標(biāo)DNA分子。這在基因組學(xué)、基因克隆、DNA測序等方面的研究中具有重要作用。

表達載體：其更復(fù)雜，它不僅可以攜帶并復(fù)制外源基因的功能，還具有在宿主細胞中表達外源蛋白的功能。表達載體通常包含啟動子和終止子等具有調(diào)控基因表達功能的序列。例如，pET系列表達載體可以在大腸桿菌中表達插入的外源基因，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)主要用于研究蛋白的功能、結(jié)構(gòu)和相互作用等。表達載體的應(yīng)用主要集中在基因表達調(diào)控研究、蛋白質(zhì)相互作用研究、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能分析、基因治療等領(lǐng)域。

總的來說，克隆載體和表達載體的主要區(qū)別在于：克隆載體主要用于獲取大量目標(biāo)DNA分子，而表達載體則主要用于在細胞內(nèi)表達目標(biāo)基因及其對應(yīng)的蛋白質(zhì)。這兩種載體在基因工程和分子生物學(xué)研究中都有廣泛的應(yīng)用，但使用的目的和場景不同。

在具體選擇載體時，需要考慮多種因素，如載體的來源、穩(wěn)定性、拷貝數(shù)、插入片段大小、轉(zhuǎn)化效率等。同時，還需要考慮實驗的目的、所需的表達水平和宿主細胞類型等因素。在克隆和表達過程中，還應(yīng)注意控制實驗條件，確保數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和可靠性。

 

3.目的基因與載體的酶切+連接

① 目的基因與載體的連接可以通過多種方法實現(xiàn)，以下是其中三種常用的方法：

粘性末端連接：將目的基因與載體用同一種限制酶酶切，產(chǎn)生相同粘性末端，再通過DNA連接酶連接。這是最常用的連接方式，連接效率高。

平端連接：將目的基因與載體切割成平端，用T4 DNA連接酶連接。這種方法需要使用高濃度的DNA和較長的連接時間。

人工接頭連接：先在DNA片段末端加上化學(xué)合成的銜接物或接頭，使之形成粘性末端之后，再用DNA連接酶將它們連接起來。

② 平末端和粘性末端在基因克隆過程中分別在不同的應(yīng)用場景下使用

平末端：在基因克隆中，平末端通常是在限制性核酸內(nèi)切酶識別位點處切割獲得的。這種情況下，限制性核酸內(nèi)切酶在識別序列的中心軸線處切開，產(chǎn)生的就是平末端。這種末端結(jié)構(gòu)在自然界中很少出現(xiàn)，但在一些實驗室技術(shù)中會使用。例如，在一些特殊情況下，例如進行基因敲除或同源重組等實驗中，平末端可能會更有效。

粘性末端：相比之下，粘性末端通常是在限制性核酸內(nèi)切酶識別位點處兩側(cè)切開獲得的。這種情況下，限制性核酸內(nèi)切酶在識別序列的中心軸線兩側(cè)將DNA的兩條鏈分別切開，產(chǎn)生的是粘性末端。這種末端結(jié)構(gòu)在自然界中很少出現(xiàn)，但在一些實驗室技術(shù)中常被使用，特別是在重組DNA技術(shù)中用于構(gòu)建重組DNA分子。粘性末端可以與另一條DNA分子的粘性末端互相配對，形成連接，因此在進行DNA重組、連接反應(yīng)時，通常會選擇使用粘性末端。

總之，平末端和粘性末端各有其特點，分別適用于不同的情況。在基因克隆過程中，需要根據(jù)具體的應(yīng)用場景來選擇使用哪種末端結(jié)構(gòu)。

③ 酶切+連接

△ 目的基因與載體的酶切和平/粘性末端連接步驟：

準(zhǔn)備相關(guān)材料：目的基因、載體、不同的限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、緩沖液等。

對目的基因和載體進行酶切：根據(jù)實驗設(shè)計，使用相應(yīng)的限制性核酸內(nèi)切酶對目的基因和載體進行酶切，產(chǎn)生相同的粘性末端或平末端。

進行連接反應(yīng)：在連接緩沖液中加入適量的T4 DNA連接酶，將純化后的目的基因與載體片段混合，進行連接反應(yīng)，形成重組DNA。

 

4.重組DNA轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)

①轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)都是生物學(xué)中常用的術(shù)語，它們的含義和區(qū)別如下：

轉(zhuǎn)化：主要應(yīng)用于原核生物，如大腸桿菌。轉(zhuǎn)化指的是將外源基因通過某些方式導(dǎo)入到原核細胞內(nèi)，實現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移。

轉(zhuǎn)染：通常是指將核酸輸送到真核細胞，有哺乳類動物細胞、酵母和昆蟲細胞等。比如將重組質(zhì)粒載體或游離核苷酸在脂質(zhì)體等介導(dǎo)下進入真核細胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染是利用真核細胞的細胞膜結(jié)構(gòu)特點，將外源基因?qū)�入到細胞�?nèi)，是基因治療、基因克隆等技術(shù)中的常用術(shù)語。

轉(zhuǎn)導(dǎo)：是指一種特定類型的感染，主要發(fā)生在病毒感染的過程中病毒感染細胞后，可以通過病毒與細胞的相互作用將外源基因?qū)�入到細胞�?nèi)，這種過程稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。

②重組DNA轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)：將重組DNA轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)導(dǎo)進入大腸桿菌細胞、酵母菌細胞、植物外植體或動物細胞內(nèi)。此后，宿主細胞會產(chǎn)生大量具有相同DNA序列的克隆細胞。

 

5.重組克隆細胞的篩選與鑒定

①目的：通過篩選和鑒定技術(shù)，確認宿主細胞中是否成功插入目標(biāo)基因。

②方法

☆ 直接電泳檢測法：從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，進行電泳，通過比較其分子量進行篩選與鑒定。

☆ β-半乳糖苷酶顯色法（藍白篩選法）：將外源DNA克隆到含有編碼α-半乳糖苷酶功能性亞基的lacZα序列的載體中，轉(zhuǎn)化成具有l(wèi)acZΔM15突變的特定大腸桿菌菌株，在提供的無色X-gal被β-半乳糖苷酶水解形成藍色顏料，通過比較菌落顏色篩選鑒定出含有外源DNA的菌落。

☆ 正向選擇向量：通過將DNA插入片段連接到克隆位點來破壞致死基因的表達。

☆ 限制酶酶切法：進行限制酶消化以確定正確的插入片段。

☆ 菌落PCR：也可以使用PCR篩選細菌菌落的方法來確定DNA插入物的存在。

 

6.重組克隆細胞擴增

①擴增：將成功插入目標(biāo)基因的宿主細胞進行培養(yǎng)，使其快速繁殖，從而獲得大量的含有目的基因的克隆細胞系。

②將成功插入目標(biāo)基因的宿主細胞進行大量培養(yǎng)，可以通過以下步驟進行：

△ 選擇合適的培養(yǎng)條件：根據(jù)宿主細胞的類型和特性，設(shè)置適合的生長條件，如溫度、濕度、營養(yǎng)物質(zhì)等。

△優(yōu)化細胞培養(yǎng)基：細胞培養(yǎng)基是細胞生長和增殖的關(guān)鍵因素之一。通過添加生長因子、激素或其他必要物質(zhì)，優(yōu)化培養(yǎng)基，使其更適于目標(biāo)細胞的生長和繁殖。

△采用適當(dāng)?shù)募毎麄鞔�方式：根�?jù)細胞的生長特性和需要，選擇適當(dāng)?shù)膫鞔�方式。常用的傳代方式有貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)等。

△細胞克隆和篩選：在初期，需要對細胞進行克隆和篩選，以獲得能夠穩(wěn)定表達目標(biāo)基因的宿主細胞系。

 

7.質(zhì)粒提取

△ 目的：將宿主細胞內(nèi)大量擴增的重組DNA片段提取出來，獲得多拷貝的目的DNA片段。

以上是分子克隆的一般步驟，后續(xù)根據(jù)自己想要研究的領(lǐng)域（DNA測序、基因表達/調(diào)控/治療/敲除、疫苗研發(fā)、藥物篩選、動植物育種等），做后續(xù)的實驗研究。