細胞外囊泡 EVs的應用之疾病診斷篇

細胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)作為細胞間信息傳遞的重要載體，其運載的蛋白質、核酸、脂質等生化分子在疾病的早期篩查、預后檢測和藥物的療效評估中具有重大潛力和臨床應用價值。相比于傳統(tǒng)生物標志物，EVs與細胞的生理狀態(tài)聯(lián)系緊密，可實時反映疾病的發(fā)生發(fā)展過程；此外，EVs來源廣泛且含量豐富，可以從尿液、血液、唾液和眼淚等生物液體中獲得，并可跨越血腦屏障等生物組織屏障。

來自美國化學協(xié)會的學者檢索并分析了CAS數據庫中EVs在治療和診斷領域中應用研究的發(fā)表情況。如圖1所示，EVs在多種疾病的治療和診斷被廣泛研究，其中與癌癥相關研究更是備受關注，文章數量占比高達68%。
 

圖1. EVs在疾病治療和診斷中的應用相關的文章分布

01 基于EVs蛋白的診斷方法
蛋白質作為EVs的重要組分，一直以來都是領域內的研究熱點。四次跨膜蛋白(Tetraspanins)作為EVs中蛋白豐度最高的一類膜蛋白，被用于多種疾病的診斷和檢測。其中，CD63在各種類型的人類癌癥細胞分泌的EVs中升高，如黑色素瘤患者血漿中CD63蛋白陽性的EVs的濃度顯著提高。CD81則在丙型肝炎中發(fā)揮著關鍵的作用，與炎癥和纖維化相關，被認為是丙型肝炎診斷標志物。CD151、CD171和TSPAN8則在肺癌患者的血清EVs中的表達量顯著提高。

來自廈門大學顏曉梅教授團隊通過NanoFCM分析了正常腸上皮細胞和結直腸癌細胞來源的EVs，發(fā)現(xiàn)結直腸癌細胞分泌的EVs中表達CD147的類群所占的比例遠高于正常腸細胞。在此基礎上進一步發(fā)現(xiàn)健康人和結直腸癌患者血漿中CD147陽性的EVs顆粒濃度存在顯著差異，且這種差異在Ⅰ期患者中即可體現(xiàn)。該團隊測定血漿中表達EBV編碼的膜蛋白LMP1和LMP2A，以及其他腫瘤標志物PD-L1、EGFR和EpCAM的EVs顆粒濃度，建立了快速、可靠、無創(chuàng)的鼻咽癌診斷方法；同時發(fā)現(xiàn)了LMP1和LMP2A陽性的EVs在甄別鼻咽癌和鼻咽炎方面具有臨床潛力（參見往期文章：廈大團隊揭秘如何通過EVs區(qū)分癌癥和炎癥）。

此外，尿液中EVs含量豐富，且無侵入性、易獲得也引起了大家的關注，被廣泛用于疾病篩查。例如，尿液的EVs被發(fā)現(xiàn)是膀胱癌、前列腺癌和腎癌等泌尿系統(tǒng)疾病的潛在生物標志物。

表1. 常見可應用于液體活檢的EVs蛋白

 

02 基于EVs核酸的診斷方法
由于受到脂質雙層脂膜的保護，EVs運載的核酸片段可免于被體液中RNA酶降解的命運。其中EVs所運載的miRNA分子是最為常見的診斷靶標，如下表2所示，EV-miRNA已被用于非小細胞肺癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、腸癌等不同類型癌癥的診斷研究中。來自路易斯維爾大學的Guilherme Rabinowits等通過核酸測序結果發(fā)現(xiàn)肺腺癌患者血液中EV-miRNA與對照組具有差異顯著，說明EV-miRNA在肺腺癌篩查的潛力。哈肯薩克大學醫(yī)學中心的研究人員發(fā)現(xiàn)EVs中miR-141被發(fā)現(xiàn)可作為前列腺癌的有效診斷標志物，且目前正在招募臨床試驗者(NCT03694483)，以開發(fā)基于EVs miR-141的前列腺癌癥液體活檢方法。而美國Exosome Diagnostics公司則開發(fā)了一種基于尿液EVs的簡單液體活檢方法——ExoDx，該方法使用EVs中ERG、PCA3和SPDEF的RNA拷貝數來實現(xiàn)前列腺癌的早期篩查。除癌癥之外，EV-RNA也被用于心血管疾病、腎纖維化以及病毒感染等疾病的診斷中。例如，來自溫州醫(yī)科大學的研究者研究了淚液來源EVs中的miR-145-5p、miR-214-3p、miR-218-5p和miR-9-5p與糖尿病視網膜病變發(fā)展過程密切相關。

然而，目前針對EV-RNA的分析方法往往通過RNA提取后，再進行采用qRCR或者核酸測序技術進行分析。EV-miRNAs的原位分析可能為解決上述缺點提供了另一種策略，即通過將特定的探針加載到單個EV中，使探針與miRNA結合并放大miRNA信號來直接檢測，從而避免EV裂解和RNA提取。來自南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院的研究者提出EV-miRNA的原位分析技術，即基于DNA納米線引導催化的發(fā)夾組裝系統(tǒng)(NgCHA)的EV-miRNA原位檢測，該團隊進一步結合NanoFCM實現(xiàn)了單EVs水平對于某一特定序列miRNA的表達分析，其性能優(yōu)于傳統(tǒng)的CHA和MB探針，該方法拓展了EV-RNA作為診斷工具的應用價值和臨床潛力。
 

表2. EV-miRNA在癌癥診斷中的應用

03 EVs相關診斷標志物臨床獲批情況
目前，EVs在疾病診斷的應用仍處于轉化醫(yī)學研究階段，獲得監(jiān)管部門批準和商業(yè)應用的產品較少。2016年，Exosome Diagnostics公司的EVs癌癥診斷產品ExoDx Lung(ALK)獲批上市，成為全球首個獲批的EVs診斷產品，基于簡單的尿液EVs液體活檢方法，該方法可快速檢測出前列腺癌患者中的EML4-ALK突變，達到了88%的靈敏度和100%的特異性，可用于協(xié)助早期診斷前列腺癌，避免不必要的前列腺活檢，該方法已于2019年獲得FDA認證。

Biological Dynamics開發(fā)了一種早期診斷檢測，利用交流電動力學(ACE)從血液中分離EVs，研究表明該檢測可在腫瘤Ⅰ期就識別胰腺癌。2023年Biological Dynamics宣布完成了其實驗室開發(fā)測試(LDT)的分析和臨床驗證，且目前正在推進與多中心合作進行胰腺癌早篩臨床試驗，加快該技術以LDT模式落地的探索過程。近期Biological Dynamics在《腫瘤學前沿》上發(fā)表病例報告“通過EVs液體活檢的多模式方法早期檢測胰腺癌前病變”。

國內方面，2022年2月，中國NMPA授予了上海思路迪的EVs卵巢癌輔助診斷試劑盒（化學發(fā)光法）以優(yōu)先審批，是國內首款同品種產品獲準注冊的醫(yī)療器械。此外，堯景基因基于糖鏈細胞外囊泡開發(fā)的GlyExo-Capture技術并基于該技術開發(fā)的肝癌檢測試劑盒已完成注冊檢驗，目前正在開展多中心臨床研究，對于細胞外囊泡技術走向臨床應用具有里程碑意義。

04 EVs分離純化方法的評估
EVs往往存在于組成成分高度復雜的體液之中，而如何從復雜的體液中以最少的樣本量獲得高純度的EV樣本，一直是該領域中亟需突破的瓶頸。表3所示是常用的EVs純化方法，無論是經典的超離法，還是新進發(fā)展的聚合物沉淀、免疫捕獲以及超濾等方法，均展現(xiàn)了各自的優(yōu)勢和局限性。然而不管選用何種分離純化方法，都需要進行嚴格的質量控制以確保EVs的富集效率和樣本純度。

1.超速離心法
基于多次差速離心和100,000 g左右的強離心力實現(xiàn)EVs的分離純化，是目前最常用的EVs分離方法之一。然后該方法較為費時費力，且易造成樣本的大量損失。而密度梯度離心則是在差速離心法的基礎上進一步通過鋪設密度層，利用密度這一性質以實現(xiàn)EVs和其他雜質的再度分離，以獲取更高純度的EVs樣本。

2.超濾法
一種基于尺寸的EVs分離純化方法，通過具有特定孔徑（限制了它們的分子量和尺寸）的膜過濾器來實現(xiàn)EVs的截留和分離。

3.尺寸排阻色譜(SEC)
則利用不同大小的顆粒流經填充柱的路徑和時間差異以實現(xiàn)EVs和其他粒徑較小的雜質顆粒的分離。目前SEC已用于從血漿、尿液、唾液和眼淚等體液中分離、純化和富集EVs。

4.聚合物沉淀法
通過聚合物對EVs進行包裹，借助低速離心的方法使EVs從生物體液中沉淀出來。這種方法易于操作，可應用于大量樣本的處理；然而該方法往往也會伴隨著體液中其他雜質顆粒的分離，且引入聚合物粒子而影響獲得的EVs樣本純度。

5.微流控裝置
可以在微小的通道內基于尺寸、密度和免疫親和性等特性來實現(xiàn)EVs的分離純化。微流控裝置體積小，且該方法樣本需求量低，在降低了時間和試劑花費的基礎上，可快速獲得純度較高的EVs樣本；然而該方法也存在著裝置較為復雜、價格昂貴和對操作者需要一定的實驗技能等要求。

6.免疫親和法
利用抗體和 EVs表面蛋白之間的相互作用來分離EVs。目前已有方法利用EVs膜表面的磷酯酰絲氨酸(Phosphatidylserine, PS)、CD9和CD63等生物分子與受體蛋白Annexin V以及對應抗體的高度選擇性和親和性，實現(xiàn)細胞培養(yǎng)上清液、血漿、尿液等多種體液中的EVs的分離純化以及高效標記，實現(xiàn)短時間、高純度、結構完整的EVs獲取以及標記。整個過程基于磁分離進行，使得EVs的捕獲及標記洗滌簡單易行。
 

表3. 用于EV分離純化的主要方法

基于不同來源EVs的高度異質性以及來源環(huán)境的復雜性，如何實現(xiàn)分離純化和質量控制，都是其臨床應用的限速步。EVs粒徑分布廣(40-1000 nm)，但是主要集中分布于200 nm以下。結合瑞利散射和鞘流單分子熒光檢測技術，廈門福流生物創(chuàng)始團隊研發(fā)成功具有自主知識產權的納米流式檢測技術，該技術可實現(xiàn)低至7 nm的納米金顆粒和24 nm低折射率二氧化硅納米顆粒散射光的直接檢測；同時配備多色熒光檢測功能，進一步揭示顆粒的生物化學性質。納米流式檢測技術使得研究人員能夠像使用傳統(tǒng)流式細胞儀分析細胞那樣對EVs進行多參數定量檢測。如下圖2所示，通過對單個納米顆粒(7-1000 nm)的粒徑、濃度以及生物化學性質的高分辨、高選擇性、高通量檢測，為生命科學研究以及生物醫(yī)藥產業(yè)的發(fā)展提供了一個強有力的表征手段。
 

圖2. 基于NanoFCM的EVs單顆粒水平分析

A. EVs的粒徑表征；B. 經跨膜核酸染料標記，EVs的核酸分析；C. EVs表面蛋白CD9和CD63的共定位分析

參考文獻

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