NSUN2介導的m5C RNA甲基化在視網(wǎng)膜母細胞瘤進展中的重要作用

視網(wǎng)膜母細胞瘤（retinoblastoma, RB）是兒童期最常見的眼內(nèi)惡性腫瘤，可導致失明甚至死亡。RB1缺失（＞90%）和MYCN擴增（～10%）被認為是致癌驅動事件，導致細胞周期更新增強和癌基因激活。最近的研究表明，表觀遺傳缺陷也參與RB腫瘤進展。NSUN2介導的N5-甲基胞嘧啶（m5C）修飾通過激活癌基因或抑制腫瘤抑制因子參與多種腫瘤的細胞增殖和侵襲。m5C在RNA代謝中起重要作用，對于維持表觀基因組穩(wěn)態(tài)至關重要。然而，m5C修飾在致癌過程中的作用尚未完全明確。

2023年5月25日，上海交通大學醫(yī)學院第九人民醫(yī)院眼科陸琳娜、柴佩韋、范佳燕等共同通訊在《Clin Transl Med》期刊發(fā)表題為“NSUN2-mediated m5 C RNA methylation dictates retinoblastoma progression through promoting PFAS mRNA stability and expression”的研究論文，探討了NSUN2介導的m5C RNA甲基化如何通過促進磷酸核糖甲酰甘氨酸脒合酶（phosphoribosylformylglycinamidine synthase，PFAS） mRNA的穩(wěn)定性和表達來影響視網(wǎng)膜母細胞瘤（RB）的進展。
 

標題：NSUN2-mediated m5C RNA methylation dictates retinoblastoma progression through promoting PFAS mRNA stability and expression（NSUN2介導的m5C RNA甲基化通過促進PFAS mRNA穩(wěn)定性和表達來決定視網(wǎng)膜母細胞瘤的進展）
時間：2023.5.25
期刊：Clin Transl Med
影響因子：IF 10.6
實驗方法：m5C甲基化RNA免疫沉淀測序（m5CmeRIP-seq）等
 
研究摘要：
本研究通過視網(wǎng)膜母細胞瘤（RB）細胞和臨床樣品中的mRNA分離和抗m5C dot blot試驗檢測全局和mRNA m5C水平。建立原位眼內(nèi)異種移植模型以檢查RB的致癌行為，病進行全基因組多組學分析以鑒定NSUN2的功能靶標，包括蛋白質(zhì)組學分析，轉錄組篩選和m5C甲基化RNA免疫沉淀測序（m5C meRIP-seq）。此外進行了基于類器官的單細胞分析和基因相關性分析，以驗證NSUN2/ALYREF/m5C PFAS致癌級聯(lián)反應。
研究結果表明，NSUN2介導的m5C RNA甲基化在RB的致癌過程中促進嘌呤的生物合成。

• 與正常視網(wǎng)膜相比，RBs中的全局和mRNA m5C水平顯著富集。
• 在RB樣品和細胞系中NSUN2的腫瘤特異性表達增加。
• 在治療上，NSUN2的靶向校正在體外和體內(nèi)均對RB中表現(xiàn)出有效的治療功效。
• 通過多組學分析，鑒定出嘌呤生物合成中的重要磷酸核糖甲酰甘氨酸脒合酶（PFAS）是NSUN2的下游候選靶標。PFAS的重新引入在很大程度上逆轉了NSUN2缺陷型RB細胞的抑制表型，表明PFAS是NSUN2的功能性下游靶標。
• m5C reader蛋白ALYREF負責識別PFAS的m5C修飾，通過增強其RNA穩(wěn)定性來增加其表達。

總之，本研究證明了NSUN2對于RB中的致癌基因激活是必需的，從而擴展了目前對腫瘤進展過程中動態(tài)m5C功能的理解。由于NSUN2/ALYREF/m5C PFAS致癌級聯(lián)是重要的RB觸發(fā)因素，因此本研究表明，靶向m5C重編程治療策略可能是一種新穎有效的抗腫瘤治療方法。
 

研究示意圖：NSUN2在視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞中上調(diào)增強了m5C甲基化，導致PFAS mRNA和蛋白質(zhì)表達增加以及腺苷酸（AMP）和鳥苷酸（GMP）含量提高，這些變化促進與視網(wǎng)膜母細胞瘤進展相關的侵襲性增加。

研究結果
（1）NSUN2表達增加增強了RB的m5C修飾水平

圖1：增加的NSUN2表達增強了視網(wǎng)膜母細胞瘤中的m5C修飾水平。
（A-B）  斑點印跡（Dot blot）顯示m5C信號與視網(wǎng)膜母細胞瘤和正常視網(wǎng)膜組織中的亞甲基藍信號的比較。數(shù)據(jù)為三個生物學重復的平均值±SD。顯著性由非配對雙尾學生t檢驗確定*p<0.05。
（C）    整合基因組學瀏覽器（IGV）顯示NSUN2在視網(wǎng)膜母細胞瘤組織中的表達高于正常視網(wǎng)膜組織。
（D）    腫瘤和正常樣品中NSUN2（綠色）和DAPI染色（藍色）的免疫熒光。比例尺：左圖，50μm；右圖，25μm。
（E-F）  斑點印跡顯示與正常視網(wǎng)膜色素上皮細胞系相比，視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞系中的m5C信號與亞甲基藍信號。數(shù)據(jù)為三個生物學重復的平均值±SD。顯著性由非配對雙尾學生t檢驗確定**p<0.01。
（G）    qPCR數(shù)據(jù)顯示NSUN2在視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞中相對于ARPE-19細胞的表達。數(shù)據(jù)為三個生物學重復的平均值±SD。顯著性由非配對雙尾學生t檢驗確定*p<0.05。
（H）   IGV顯示與視網(wǎng)膜色素上皮細胞系相比，視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞系中NSUN2的更高表達。
（I）   Western blot數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析顯示，相對于ARPE-19細胞，視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞中NSUN2表達。數(shù)據(jù)為三個生物學重復的平均值±SD。顯著性由非配對雙尾學生t檢驗確定。*p<0.05，**p<0.01。
（J）   單細胞轉錄組分析揭示了視網(wǎng)膜母細胞瘤中相對NSUN2蛋白表達與不同生物學過程之間的相關性*** p<0.001
 
（2）NSUN2在體外和體內(nèi)促進RB的惡性增殖

圖2：NSUN2在體外和體內(nèi)促進視網(wǎng)膜母細胞瘤的惡性增殖。
（A）   qPCR數(shù)據(jù)顯示NSUN2敲低后視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞（Y79和WERI-RB1）中NSUN2表達。數(shù)據(jù)為三個生物學重復的平均值±SD。顯著性由非配對雙尾學生t檢驗確定。*p<0.05，**p<0.01。
（B）   Western Blot顯示NSUN2敲低后視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞（Y79和WERI-RB1）中NSUN2表達。數(shù)據(jù)為三個生物學重復的平均值±SD。顯著性由非配對雙尾學生t檢驗確定。*p<0.05。
（C）   IGV顯示NSUN2敲低后視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞（Y79）中NSUN2表達。
（D）   斑點印跡顯示NSUN2敲低后視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞（Y79和WERI-RB1）中相對于亞甲藍信號的m5C信號。
（E）   CCK-8實驗評估NSUN2敲低后視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞（Y79和WERI-RB1）的增殖。數(shù)據(jù)為三個生物學重復的平均值±SD。顯著性由非配對雙尾學生t檢驗確定。*p<0.05，***p<0.001。
（F-G） 采用軟瓊脂測定法評估NSUN2敲低后視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞（Y79和WERI-RB1）的增殖。顯示了來自三個重復的代表性圖像。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD。顯著性由不成對的兩尾學生t檢驗確定**p<0.01，***p<0.001。
（H-I）  BALB/c裸鼠和含有源自NSUN2缺陷型Y79細胞的異種移植物的眼球圖像。顯示六個生物學重復的代表性圖像。
（J）    眼球重量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。H＆E染色以評估腫瘤形成。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD。顯著性由不成對的兩尾學生t檢驗確定***p<0.001。
（K）   免疫組化染色圖像顯示對照組和NSUN2敲低組中Ki-67和NSUN2表達。比例尺：50μm。
 
（3）PFAS調(diào)控NSUN2的m5C修飾
 

圖3：多組學分析以鑒定NSUN2的潛在RNA靶標。
（A）   火山圖顯示NSUN2缺陷型視網(wǎng)膜母細胞瘤（Y79）細胞中NSUN2調(diào)控的基因。
（B）   NSUN2缺陷型視網(wǎng)膜母細胞瘤（Y79）細胞中NSUN2調(diào)控基因的KEGG通路分析。
（C）   火山圖顯示NSUN2缺陷型視網(wǎng)膜母細胞瘤（Y79）細胞中NSUN2調(diào)控的蛋白質(zhì)。
（D）   NSUN2缺陷型視網(wǎng)膜母細胞瘤（Y79）細胞中NSUN2調(diào)控蛋白的GO富集分析。
（E）    m5C meRIP-seq數(shù)據(jù)顯示m5C位點的peaks值密度。分析了生物學重復樣品。
（F）   視網(wǎng)膜母細胞瘤（Y79）細胞和正常視網(wǎng)膜組織中m5C修飾基因的KEGG通路分析。

 

圖4：PFAS調(diào)節(jié)NSUN2的m5C修飾。
（A）   多組學分析將PFAS鑒定為NSUN2的下游標靶。
（B）   m5C meRIP-seq分析的IGV軌跡顯示PFAS的m5C富集。分析了生物學重復樣本。
（C）   視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞和視網(wǎng)膜色素上皮細胞中PFAS中m5C狀態(tài)的m5C-MeRIP qPCR檢測。數(shù)據(jù)三個生物學重復是平均值±SD。顯著性由非配對雙尾學生t檢驗確定。*p<0.05，**p<0.01。
（D）   m5C-MeRIP qPCR檢測NSUN2缺陷型視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞中PFAS中m5C狀態(tài)。數(shù)據(jù)三個生物學重復是平均值±SD。顯著性由非配對雙尾學生t檢驗確定。
（E）   qPCR數(shù)據(jù)顯示NSUN2敲低后視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞（Y79和WERI-RB1）中PFAS的表達。數(shù)據(jù)三個生物學重復是平均值±SD。顯著性由非配對雙尾學生t檢驗確定。*p<0.05，**p<0.01。
（F）   Western Blot分析顯示NSUN2敲低后視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞（Y79和WERI-RB1）中PFAS的表達。數(shù)據(jù)三個生物學重復是平均值±SD。顯著性由非配對雙尾學生t檢驗確定。**p<0.01，***p<0.001。
（G）  免疫組織化學染色圖像顯示對照組和NSUN2敲低組中PFAS表達。比例尺：左圖，50μm；右圖，25μm。
（H）  視網(wǎng)膜母細胞瘤樣本隊列中NSUN2表達和PFAS表達的相關性分析（n=76）。通過Pearson相關分析確定顯著性（R=0.505，p=3.32e-06）。
 
（4）PFAS是NSUN2的功能性下游標靶

圖5：PFAS是NSUN2的功能性下游靶標。
  （A） qPCR數(shù)據(jù)顯示與ARPE-19細胞相比，視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞中PFAS的表達。數(shù)據(jù)以三次重復的平均值±標準差（SD）呈現(xiàn)。顯著性通過非配對雙尾學生t檢驗確定。**p < .01，***p < .001。
  （B）IGV顯示與正常視網(wǎng)膜組織相比，視網(wǎng)膜母細胞瘤中PFAS的更高表達。
  （C）Western Blot分析顯示與ARPE-19細胞相比，視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞中PFAS的表達。數(shù)據(jù)代表三次重復的平均值±標準差。顯著性通過非配對雙尾學生t檢驗確定。***p < .001。
  （D）免疫熒光顯示腫瘤和正常樣本中PFAS（綠色）和DAPI染色（藍色）。比例尺：左圖，50μm；右圖，25μm。
 （E） Western Blot分析顯示不同組別視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞中PFAS的表達。數(shù)據(jù)以三次重復的平均值±標準差呈現(xiàn)。顯著性通過非配對雙尾學生t檢驗確定。***p < .001，****p < .0001。
 （F） CCK8實驗評估NSUN2缺陷的視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞在PFAS過表達后的增殖能力。數(shù)據(jù)以三次重復的平均值±標準差呈現(xiàn)。顯著性通過非配對雙尾學生t檢驗確定。*p < .05，**p < .01。
(G-H)  軟瓊脂實驗評估NSUN2缺陷的視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞在PFAS過表達后的增殖能力。數(shù)據(jù)以三次重復的平均值±標準差呈現(xiàn)。顯著性通過非配對雙尾學生t檢驗確定。**p < .01，***p < .001。N.S.表示無顯著性。
(I-J)   BALB/c裸鼠和含有源自NSUN2缺陷且PFAS過表達的Y79細胞的異種移植物的眼球圖像。眼球重量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以平均值±標準差呈現(xiàn)。顯著性通過非配對雙尾學生t檢驗確定。**p < .01，****p < .0001。
(K)    在NSUN2缺陷的視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞中檢測到PFAS過表達后的腺苷酸（AMP）和鳥苷酸（GMP）濃度。
(L)    單細胞轉錄組分析揭示了在視網(wǎng)膜母細胞瘤中相對PFAS蛋白表達與不同生物過程之間的相關性。**p < .01，***p < .001。
 
（5）ALYREF識別m5C甲基化的PFAS并促進其RNA穩(wěn)定性

圖6：ALYREF識別m5C甲基化的PFAS并促進其RNA穩(wěn)定性。
（A）在用放線菌素D（10 μg/μL）處理0-10小時的NSUN2缺陷的視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞中PFAS的半衰期。
（B）RIP-qPCR檢測ALYREF和YBX1誘導的視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞（Y79）中PFAS的表達。
（C）單細胞轉錄組分析揭示視網(wǎng)膜母細胞瘤中相對ALYREF蛋白表達與不同生物過程之間的相關性。
（D）視網(wǎng)膜母細胞瘤樣本隊列中ALYREF表達和PFAS表達的相關性分析（n=76）。
（E）qPCR數(shù)據(jù)顯示ALYREF敲除后視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞（Y79和WERI-RB1）中PFAS的表達。
（F）Western Blot分析顯示ALYREF敲除后視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞（Y79和WERI-RB1）中PFAS的表達。
（G）放線菌素D（10 mg/mL）處理ALYREF缺陷型視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞0-10小時PFAS的半衰期。
（H）CCK-8實驗評估ALYREF敲除后視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞（Y79和WERI-RB1）的增殖能力。
(I-J) 軟瓊脂實驗評估ALYREF敲除后視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞（Y79和WERI-RB1）的增殖能力。
(K-L) BALB/c裸鼠和含有源自ALYREF缺陷的Y79細胞的異種移植物的眼球圖像。眼球重量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。
 
研究小結：
這項研究最初證明了NSUN2通過增強其在RB中的RNA穩(wěn)定性來激活PFAS，擴展了目前對腫瘤進展過程中動態(tài)m5C功能的理解。值得注意的是，RNA上的m5C修飾對于嘌呤合成很重要，彌合了目前對RNA修飾和代謝重編程的理解。由于NSUN2/ALYREF/m5C PFAS致癌級聯(lián)是RB的重要觸發(fā)因素，因此本研究提供了一種新的治療策略，即“靶向m5C重編程策略”，這可能是一種有效的抗腫瘤治療方法。

參考文獻：
Zuo S, Li L, Wen X, Gu X, Zhuang A, Li R, Ye F, Ge S, Fan X, Fan J, Chai P, Lu L. NSUN2-mediated m5 C RNA methylation dictates retinoblastoma progression through promoting PFAS mRNA stability and expression. Clin Transl Med. 2023 May;13(5):e1273. doi: 10.1002/ctm2.1273. PubMed PMID: 37228185.