分子相互作用儀在小化合物對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體刺激分析中的應(yīng)用

簡(jiǎn)介
       G蛋白偶聯(lián)受體(gpcr)是一個(gè)跨膜蛋白大家族，參與許多生理和病理過程。細(xì)胞外刺激導(dǎo)致細(xì)胞反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物有序和動(dòng)態(tài)的再分配。細(xì)胞反應(yīng)是受體類型特異性的。因此，將gpcr分為Gi/o、Gq/11、Gs和G12/13四個(gè)亞類。
       實(shí)時(shí)無標(biāo)記的細(xì)胞分析提供了亞型特異性的概況，而不需要標(biāo)記。然而，可用的檢測(cè)方法是基于附加拮抗劑或其他反應(yīng)修飾劑的多步驟分析，這在尚未發(fā)現(xiàn)特定途徑的拮抗劑的情況下尤其成問題。
       多參數(shù)表面等離子體共振(MP-SPR)是一種實(shí)時(shí)無標(biāo)記檢測(cè)方法，可以檢測(cè)傳感器表面的變化，如配體結(jié)合、分子重排和細(xì)胞粘附。由于其多參數(shù)方法，可以實(shí)時(shí)跟蹤多個(gè)參數(shù)(圖1)。例如，峰值角位置信號(hào)(PAP)檢測(cè)GPCR激活期間細(xì)胞中發(fā)生的細(xì)微質(zhì)量重分布。相反，峰值最小強(qiáng)度(PMI)受SPR耦合角反射回的光量的影響。通過這種方式，不同的MP-SPR反應(yīng)單獨(dú)或相互結(jié)合，可以在單步分析中研究不同的GPCR途徑，而無需事先進(jìn)行細(xì)胞處理，使用拮抗劑或途徑調(diào)節(jié)化合物。
 

圖1：MP-SPR儀器可以連續(xù)測(cè)量全SPR曲線，并可以實(shí)時(shí)跟蹤多個(gè)參數(shù)，包括峰值角位置信號(hào)(PAP)和峰值最小強(qiáng)度(PMI)。

材料和方法
        將離體細(xì)胞懸液移至SPR102-AU傳感器上，將HeLa、CHO-K1或A431細(xì)胞固定在SPR102-AU傳感器上。對(duì)于HeLa細(xì)胞，首先用人纖維連接蛋白包裹傳感器。帶細(xì)胞的傳感器在37℃下培養(yǎng)至完全融合。光鏡下觀察細(xì)胞融合、形態(tài)學(xué)和單層完整性。
       測(cè)量采用MP-SPR Navi™220A NAALI儀器，流速為20-30 μL/min，溫度為37℃。運(yùn)行緩沖液相當(dāng)于用于細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。樣品注射15分鐘。不含活性化合物的參比樣品被注入第二個(gè)通道。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用臺(tái)盼藍(lán)處理細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞活力。

結(jié)果和討論
       A431細(xì)胞受到緩激肽和腎上腺素的刺激。緩激素與緩激素B2受體結(jié)合，激活Gq通路，而腎上腺素與β2腎上腺素受體結(jié)合，激活Gs通路(圖2)。不同濃度的腎上腺素和緩激素刺激A431細(xì)胞導(dǎo)致獨(dú)特的時(shí)間依賴性PAP譜(圖3)。組胺結(jié)合組胺H1和H3受體，分別激活Gq和Gi通路。這導(dǎo)致了同樣獨(dú)特的PAP譜(數(shù)據(jù)未顯示)。

圖2：腎上腺素刺激β2-腎上腺素受體激活Gs通路，緩激素B2受體激活Gq通路。


圖3：用緩激素或腎上腺素刺激A431細(xì)胞可產(chǎn)生獨(dú)特的PAP譜。

     
      除了PAP，其他幾種SPR信號(hào)反應(yīng)也表現(xiàn)出一致的和通路依賴的變化。當(dāng)繪制這些信號(hào)響應(yīng)與PAP響應(yīng)的對(duì)比圖時(shí)，尤其是PMI，每個(gè)分析的GPCR信號(hào)通路都有明確的可區(qū)分模式(圖4)。
 

圖4：雙參數(shù)PMI-PAP反應(yīng)譜，PAP(峰值角位置)反應(yīng)與PMI(峰值最小強(qiáng)度)反應(yīng)對(duì)應(yīng)，不同激動(dòng)劑和細(xì)胞系的明確可區(qū)分模式。
 

       為了證實(shí)觀察到的細(xì)胞反應(yīng)是特異性的gpcr，細(xì)胞要么用組胺受體拮抗劑和G蛋白抑制劑處理，要么不轉(zhuǎn)染組胺受體。結(jié)果，這些細(xì)胞對(duì)300nM組胺處理沒有反應(yīng)。
       將MP-SPR PAP響應(yīng)與使用諧振波導(dǎo)光柵(另一種用于無標(biāo)簽細(xì)胞測(cè)量的光學(xué)方法)測(cè)量的響應(yīng)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)了相似的濃度響應(yīng)曲線。

總結(jié)
       由于其在生理過程中的核心作用，gpcr作為新藥物化合物的靶點(diǎn)被廣泛研究。結(jié)合全SPR曲線峰的動(dòng)態(tài)角度(PAP)和強(qiáng)度(PMI)變化，MP-SPR用于將活細(xì)胞中活化的gpcr分離成亞型特異性信號(hào)通路，而不使用拮抗劑或其他反應(yīng)調(diào)節(jié)劑。