通過(guò) DEL 篩選發(fā)現(xiàn)新型 Mcl-1 抑制劑的全過(guò)程介紹

 司美格魯肽獲批上市，全球刮起“肽肽風(fēng)”。  你知道嗎？“肽肽”們也有幫派: 線性肽和環(huán)狀肽。  更高的靶點(diǎn)親和力、更好的代謝穩(wěn)定性、更佳的生物膜透性……本期小 M 為大家介紹“好肽肽”環(huán)狀肽聯(lián)合 DEL 篩選如何破局 Mcl-1 成藥難問題？  

01
環(huán)肽：破局難成藥蛋白！
 
逃避細(xì)胞凋亡對(duì)腫瘤的發(fā)展和生長(zhǎng)至關(guān)重要，Mcl-1  (Myeloid cell leukemia 1) 是 Bcl-2 (B-cell lymphoma-2) 蛋白家族中重要的抗凋亡蛋白之一，對(duì)腫瘤的生存起到關(guān)鍵的保護(hù)作用。開發(fā) Mcl-1 抑制劑意味著需要阻斷蛋白-蛋白相互作用，通常需要對(duì)結(jié)構(gòu)更復(fù)雜更大的分子進(jìn)行漫長(zhǎng)的優(yōu)化。

近日，荷蘭的 Symeres 制藥公司在藥物化學(xué) TOP 期刊 JMC 上介紹了通過(guò) DEL 篩選發(fā)現(xiàn)新型 Mcl-1 抑制劑的全過(guò)程，小 M 將基于此研究跟大家分享該藥物分子的開發(fā)過(guò)程。

圖 1. 新型 Mcl-1 抑制劑的開發(fā)過(guò)程^[1]。

文獻(xiàn)要點(diǎn)：

• Mcl-1 的抑制需要阻斷蛋白-蛋白相互作用，這通常需要相對(duì)比較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜的(半) 肽類化合物來(lái)實(shí)現(xiàn)。

• 使用 DNA 編碼環(huán)肽庫(kù)和 DEL 篩選來(lái)直接篩選結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大環(huán)化合物得到 3 個(gè)苗頭分子，但是溶解性和透膜性差，以及活性需要進(jìn)一步的提升。

• 通過(guò)配體-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析確認(rèn)苗頭分子 cpd3 的構(gòu)象�；�于口袋分析，認(rèn)為 P1’口袋可以進(jìn)一步誘導(dǎo)，以此為重點(diǎn)改構(gòu)方向提升分子活性以及優(yōu)化分子的理化性質(zhì)。

• 保持大環(huán)骨架不變，針對(duì)性的對(duì) P1’口袋處的側(cè)鏈進(jìn)行優(yōu)化。引入苯環(huán)進(jìn)一步占據(jù) P1’口袋，活性可以提升 100 倍，苯環(huán)上再引入柔性基團(tuán)可以提升透膜性，引入雜原子或者新的基團(tuán)降低 LogD，可以提高溶解性，最終得到 2 個(gè)先導(dǎo)化合物 57/59，適合未來(lái)進(jìn)一步的開發(fā)用于疾病的治療。
   

02
DEL 篩選：發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵的苗頭分子

在過(guò)去的 5-10 年里，文獻(xiàn) (專利) 中披露了一系列有潛力的 Mcl-1 選擇性抑制劑，其中一些化合物已推入臨床，但結(jié)果不是很理想，并且存在某些毒性問題。鑒于抑制 Mcl-1 的功能需要破壞蛋白-蛋白相互作用，大多數(shù) Mcl-1 抑制劑的部分理化性質(zhì)不符合 Lipinski 類藥五原則，如 LogP, PSA 和 MW 等。

圖 2 展示了過(guò)去十年報(bào)道的代表性的選擇抑制劑，這些化合物都是從較小的非環(huán)分子演化來(lái)的，在先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)和改構(gòu)過(guò)程中存在著許多明顯的挑戰(zhàn)，而通過(guò)高通量篩選識(shí)別到有活性的大環(huán)分子需要異常龐大和多樣化的化合物庫(kù)，這通常只有 DNA 編碼化合物庫(kù) (DEL) 才能做到。

圖 2. 不同類型的 Mcl-1 抑制劑結(jié)構(gòu)^[1]。

 
DEL 篩選這么牛，研究人員是怎么做到的呢？

▐  第一步：DEL 建庫(kù)。

該 DNA kit 由 21 種 DEL Library 混和而成，每個(gè) Library 由一套獨(dú)特的 DNA 兼容反應(yīng)和一系列的分子砌塊構(gòu)建而成，庫(kù)中每個(gè)分子以共價(jià)鍵的形式連接了一段記錄其分離與合并過(guò)程并允許其識(shí)別的唯一的 DNA 序列。其中 1 個(gè) Library 為一個(gè)環(huán)肽庫(kù)，通過(guò) 4 輪建庫(kù)而成，含有 15 億的環(huán)肽分子。

▐  第二步：DEL 親和篩選。

研究人員分別做了 5 個(gè)篩選條件，篩選的蛋白分別是 Mcl-1 (172−327)，Mcl-1 (172−327) with 80 μM BIM peptide，Mcl-1  (33−327)，Bcl-xl (和 Mcl-1 屬于同一家族，需要做出選擇性) 以及 No target (陰性對(duì)照)。

▐  第三 ~ 四步：DNA 解碼和數(shù)據(jù)分析。 

通過(guò)深度測(cè)序?qū)Σ煌�篩選條件的結(jié)果進(jìn)行解碼并分類統(tǒng)計(jì)分析，可以發(fā)現(xiàn)許多富集度很高的分子砌塊組合在不同的篩選條件中都被鑒定出來(lái)。所有這些化合物在長(zhǎng)和短的 Mcl-1 中都有富集，并且和 BIM 肽具有競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，同時(shí)大多數(shù)富集化合物對(duì)脫靶蛋白 Bcl-xl 也有富集�？上攵�知發(fā)現(xiàn)選擇性靶向 Mcl-1 而非靶向 Bcl-xl 的分子的困難性是很高的。

圖 3b,3c 三維立方圖 x 軸，y 軸代表不同建庫(kù)階段的分子砌塊，Z 軸為富集結(jié)果，藍(lán)色點(diǎn)為富集度好的含有 2 種分子砌塊的系列分子 ，圖 3d 為綜合分析后，選出的選擇性靶向 Mcl-1，且富集度好的一系列分子砌塊信息，基于該信息可以推測(cè)出活性分子的結(jié)構(gòu)。

▐  第五步：off-DNA 合成和活性驗(yàn)證。

如圖 3e 所示，DEL 篩選出的大環(huán)化合物 (1/2/3) 與 Mcl-1 具有可觀的結(jié)合親和力 (50-130 nM)，且對(duì) Bcl-xl 沒有活性，是非常好的起始優(yōu)化分子。同時(shí)因?yàn)檫@些分子屬于半肽類分子，研究人員也測(cè)了代謝穩(wěn)定性，結(jié)果表明這些分子具有足夠的代謝穩(wěn)定性用于下一步的分子改造。此外，這 3 個(gè)大環(huán)分子的細(xì)胞活性測(cè)試結(jié)果較差，同時(shí)溶解性也較差，因此接下來(lái)的工作主要在優(yōu)化分子的細(xì)胞活性和理化性質(zhì)上。

圖 3. DEL 篩選發(fā)現(xiàn)苗頭分子流程^[1]。

(a) DEL 篩選工作流程，I：設(shè)計(jì)與合成 DNA 編碼化合物庫(kù)；II：通過(guò)親和篩選找到和靶蛋白有親和力的分子；III：使用深度測(cè)序 DNA 標(biāo)簽對(duì)選擇輸出進(jìn)行表征；IV：通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析鑒定富集化合物；V：合成代表性 Off-DNA 化合物；VI：生物活性驗(yàn)證。(b-c) 四環(huán)肽 DEL 庫(kù)針對(duì) Mcl-1 (172-327) 篩選的富集數(shù)據(jù)分析，藍(lán)色點(diǎn)代表富集度好的化合物系列；(d)“SAR”信息體現(xiàn)富集度高的四輪建庫(kù)分子砌塊中。(e) Off-DNA 分子活性驗(yàn)證：^aIC₅₀ values determined in an Mcl-1-BAK time-resolved fluorescence resonance energy transfer  (TR-FRET) assay；^bIC₅₀ values determined in an NCI-H929 cell viability assay；^cIC₅₀ values determined in a Bcl-xl-BAK TR-FRET assay。

 
03
共晶結(jié)構(gòu)：化合物改構(gòu)的關(guān)鍵指導(dǎo)

如圖 4，研究人員詳細(xì)分析了化合物 1 和 Mcl-1 蛋白的結(jié)合模式，該大環(huán)分子在 P1-P4 口袋都占據(jù)，占據(jù) P3, P4 口袋的片段相互作用比較多。

其中，Phe-Phg 片段占據(jù) P4 口袋，苯丙氨酸側(cè)鏈貼著由 Phe318/319 形成的疏水表面，同時(shí)占據(jù)了由纈氨酸 216、220、265 和甘氨酸 262 形成的小的疏水口袋。形成大環(huán)的肽鏈在該區(qū)域有不少的氫鍵作用，順式氨基環(huán)己基乙酸片段位于 P3 口袋，其羰基與 His-224 形成氫鍵作用，同時(shí)該順式構(gòu)型對(duì)誘導(dǎo)分子其他片段更深入的進(jìn)入 P1 口袋有非常重要的作用。
 

 
位于 P1 和 P2 口袋的片段形成的相互作用不是很多，主要是疏水作用。值得注意的是，研究人員發(fā)現(xiàn)許多已報(bào)道的 Mc1-1 抑制劑占據(jù)了 P1’誘導(dǎo)口袋，然而化合物 1 沒有占據(jù)該區(qū)域，并且該誘導(dǎo)口袋看起來(lái)沒有出現(xiàn)。

為了進(jìn)一步研究 P1/P1’口袋，如圖 5，研究人員將化合物 1 的復(fù)合物共晶結(jié)構(gòu)與另一個(gè) Mcl-1 抑制劑的共晶結(jié)構(gòu)疊合，可以明顯的看出 P1’口袋還有更多的優(yōu)化空間，因此接下來(lái)的優(yōu)化工作主要集中對(duì) P1’口袋處的小分子側(cè)鏈進(jìn)行優(yōu)化。

圖 5. 化合物 1與 Mcl-1 蛋白共晶結(jié)構(gòu)與已報(bào)道 Mcl-1 抑制劑復(fù)合物共晶結(jié)構(gòu)疊合圖 (PDB 5FDR) ^[1]。

   
04
改構(gòu)：提升活性，優(yōu)化理化性質(zhì)

如表 1，化合物 (34-37) 在 R 處引入苯環(huán)占據(jù) P1 口袋，活性即有提升�；�合物 (38-42) 引入更長(zhǎng)的聯(lián)苯炔，活性得到顯著的提升。其中對(duì)叔丁基苯基衍生物 41 的酶活為 1.8 nM。
盡管酶活有所提升，但在細(xì)胞活性方面未觀察到改善，在 H929 增殖和 Caspase 檢測(cè)中，IC₅₀ 值仍然在低微摩爾范圍內(nèi)。

研究人員假設(shè)是由于該大環(huán)分子的剛性結(jié)構(gòu)以及聯(lián)苯，聯(lián)苯炔都缺乏柔性，從而透膜性不好，于是引入略微靈活的芳基醚來(lái)解決該問題，結(jié)果表明化合物 43 和 44 的酶活以及細(xì)胞活性都提升到納摩爾級(jí)別。

雖然對(duì) P1'-口袋的優(yōu)化將活性提升 2 個(gè)數(shù)量級(jí)，但是 cLogD 顯著增加，從化合物 3 的 5.1 增加到化合物 44 的 8.2，化合物 44 的溶解性低于 2 μM。因此，需要進(jìn)一步優(yōu)化分子整體的理化性質(zhì)。

如表 2，基于前期的相互作用分析，主要對(duì) R1，R2，R3 和 R4 基團(tuán)進(jìn)行微調(diào)，具體的方法主要是引入雜原子和極性基團(tuán)來(lái)降低 cLogD。最終找到 57,59 這兩個(gè)分子，具有可觀的細(xì)胞活性，適當(dāng)?shù)耐改ば院蛢?yōu)秀的溶解性，適合未來(lái)進(jìn)一步的開發(fā)用于疾病的治療。

表 2. 理化性質(zhì)優(yōu)化^[1]。

 

MCE 的 DEL 庫(kù)：

MCE 擁有 68 個(gè)多樣性的 DEL 庫(kù)，如優(yōu)勢(shì)骨架型、天然產(chǎn)物類似物型、環(huán)肽型、共價(jià)型等，含數(shù)十億 DEL 分子，可進(jìn)一步通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，解碼 DEL 分子的專屬 DNA 標(biāo)簽，快速獲得針對(duì)靶點(diǎn)的苗頭化合物信息。這些 DEL 分子代表的化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎，化學(xué)空間覆蓋范圍廣，具備類藥分子特性。結(jié)合平臺(tái)強(qiáng)大的 DEL 庫(kù)個(gè)性化定制、重組蛋白定制、先導(dǎo)化合物優(yōu)化技術(shù)及豐富的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，MCE 可真正提供一站式 DEL 庫(kù)及 DEL 庫(kù)篩選服務(wù)。

05
小結(jié)

以上，小 M 給大家分享了一篇比較完整的基于 DEL 環(huán)肽庫(kù)的篩選案例，希望可以幫助大家更進(jìn)一步的了解 DEL 篩選~

產(chǎn)品推薦

DNA 編碼化合物庫(kù)合成與篩選 DNA 編碼化合物庫(kù)（DNA Encoded compound Library, DEL）技術(shù)作為新穎、強(qiáng)大的苗頭化合物發(fā)現(xiàn)引擎，可快速?gòu)膸浊�萬(wàn)至數(shù)十億分子中，遴選出結(jié)構(gòu)新穎、具有潛在成藥性的化合物，大大縮短藥物研究周期，降低研發(fā)成本。在 DEL 庫(kù)中，每一個(gè)分子砌塊（Building Block）都由一段已知唯一的 DNA 序列進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò) DNA 兼容反應(yīng)和組合化學(xué)模式，歷經(jīng)數(shù)個(gè)循環(huán)即可獲得上億 DEL 分子。數(shù)十億化合物可以混合在一管中篩選，最終通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，解碼 DEL 分子的專屬 DNA 標(biāo)簽，快速獲得針對(duì)靶點(diǎn)的苗頭化合物信息。

50K Diversity Library 由 50,000 種類藥化合物組成。本多樣性庫(kù)具備新穎性、類藥性，結(jié)構(gòu)多樣性等特點(diǎn)，庫(kù)中化合物可重復(fù)供應(yīng)，是新藥研發(fā)的有力工具，可以廣泛地應(yīng)用于高通量篩選 (HTS) 和高內(nèi)涵篩選 (HCS)。

5K Scaffold Library 由 5,000 種類藥化合物組成，每種化合物代表一種結(jié)構(gòu)骨架，最大程度保證了庫(kù)的結(jié)構(gòu)多樣性。庫(kù)中的化合物均經(jīng)過(guò) MedChem & PAINS filters 篩選，剔除了不合適的化學(xué)結(jié)構(gòu)，避免“目標(biāo)錯(cuò)誤”。本庫(kù)化合物數(shù)量少但結(jié)構(gòu)足夠多樣，是藥物篩選的有力工具。

3D Diverse Fragment Library 由 5,196 個(gè)非平面片段分子組成（平均 Fsp3 值為 0.58），超過(guò) 4,700 個(gè)片段至少包含一個(gè)手性中心。本庫(kù)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵元素是 3D 結(jié)構(gòu)、多樣性、生物反應(yīng)性等，有效提高了片段潛在生物活性，為基于片段的藥物發(fā)現(xiàn)提供了更高的片段命中概率。

Drug Fragment Library MCE Drug Fragment Library 由 1,000 個(gè)藥物片段組成。這些藥物片段來(lái)自 2,946 個(gè) FDA 已批準(zhǔn)的藥物分子，同一藥物的不同片段可以出現(xiàn)在其他藥物中，這些片段和 PK/PD 性質(zhì)存在一定的相關(guān)性，基于片段的篩選可以為后續(xù)優(yōu)化結(jié)構(gòu)預(yù)留出足夠的化學(xué)空間，該化合物庫(kù)是 FBDD（基于片段的藥物設(shè)計(jì)）藥物篩選的必備工具。

參考文獻(xiàn)：
[1]. Hekking KFW, et al. Development of Potent Mcl-1 Inhibitors: Structural Investigations on Macrocycles Originating from a DNA-Encoded Chemical Library Screen. J Med Chem. 2024 Feb 22;67 (4):3039-3065.