使用光片顯微鏡進行人類早期大腦類器官發(fā)育的形態(tài)動力學(xué)研究
在本例中，作者建立了長期的活體光片顯微鏡技術(shù)，應(yīng)用于由熒光標記的人類誘導(dǎo)多能干細胞生成的無指導(dǎo)腦類器官，這使得我們能夠在類器官發(fā)育的數(shù)周內(nèi)跟蹤組織形態(tài)、細胞行為和亞細胞特征，為研究人類大腦形態(tài)動力學(xué)提供了新的途徑，并支持基質(zhì)相關(guān)的機械感知動態(tài)在大腦區(qū)域化過程中發(fā)揮核心作用的觀點。
稀疏和多位點熒光標記腦類器官的
長期活體成像
01、類器官的培養(yǎng)
本研究中使用的細胞系為：
❖Histone2B-mEGFP 均勻標記細胞核
❖mEGFP-Beta-Actin 均勻標記 ACTB
❖mTagRFP–T–CAAX 標記細胞膜
❖mTagRFP–T-LaminB1 標記 LMNB1
❖未標記的 WTC iPSCs
操作流程：
- 干細胞系按標準流程培養(yǎng)和傳代
- 96孔板，每孔加入500個細胞/3000個細胞，在 mTSR+中（加入1:200 ROCKi和1:200Pen-strep），并以 200g離心5分鐘以生成胚體（EBs）
- 在第 2 天更換新鮮的 mTSR+，加入1:200 ROCKi 和 1:200 Pen-strep
- 第 4 天提供含 2%溶解的 matrigel 的新鮮神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并每隔一天更換一次
- 第 10 天提供含 2% matrigel 的分化培養(yǎng)基-VitA，并在第 15 天提供含 1% matrigel 的分化培養(yǎng)基+ VitA
- 第 15 天將類器官轉(zhuǎn)移到 24 孔板中，每孔一個類器官，并轉(zhuǎn)移到搖床上，隨后在一個月時將每孔一個類器官轉(zhuǎn)移到 6 孔板中，并保持在搖床上
- 嵌入基質(zhì)膠中，并培養(yǎng)在樣本室微孔中的細胞球用于光片成像
02、長期活體成像觀察
胚胎體（4 個）嵌入溶解在神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的 20-50%基質(zhì)膠中或覆蓋在 0.6%的低熔點瓊脂糖上。
圖2.稀疏和多位點熒光標記腦類器官的長期活體成像.f、4 個不同類器官（第 15 天）的 3D 投影（左）和橫截面（右），用全切片熒光原位雜交鏈反應(yīng)（HCR）染色標記轉(zhuǎn)錄本。比例，100 微米。g) 從 188 小時成像實驗中 75 小時成像的最大投影圖像。類器官包含 5 種不同的細胞系，這些細胞系具有穩(wěn)定的蛋白質(zhì)遺傳標記，使用紅色或綠色熒光蛋白（RFP，GFP），以及未標記的細胞。比例，100 微米。h) 組織器切片（84 小時）顯示核膜（Lamin，RFP，品紅色）、質(zhì)膜標記（CAAX，RFP，品紅色）、肌動蛋白（GFP，綠色）、微管蛋白（RFP，品紅色）和細胞核（組蛋白，GFP，綠色）。i) 不同時間點的圖像顯示最大強度投影（左半部分）和切片（右半部分）。
每兩天更換一次培養(yǎng)基。成像使用 Viventis LS1 Live 光片顯微鏡進行，具體設(shè)置如下：
- 物鏡——25X NA1.1水鏡
- 成像視野——710μm
- xy 像素大小——0.347μm
- Z軸步徑——2μm，201 步
- 采集幀率為——30 分鐘
外源性細胞外基質(zhì)影響大腦類
器官的形態(tài)發(fā)生
為了量化類器官之間的形態(tài)動態(tài)變化，作者利Viventis LS2光片顯微鏡低光毒性、多位點、多視角的成像能力，一次成像并行記錄16個類器官通過統(tǒng)計分析不同時間點類器官體積、腔室體積和腔室數(shù)量，結(jié)果突出了早期大腦類器官發(fā)育的三個形態(tài)動力學(xué)階段，包括：
❖快速組織和腔體生長的早期階段
❖涉及腔體融合事件的組織穩(wěn)定階段
❖神經(jīng)上皮成熟的最終階段
對比用基質(zhì)膠、低熔點瓊脂糖和不使用任何外源基質(zhì)培養(yǎng)類器官，使用光片長時間跟蹤類器官動力學(xué)，結(jié)果顯示外源細胞外基質(zhì)的存在對人腦類器官的組織尺度形態(tài)發(fā)生有重大影響，且改變的組織極性可能會影響成熟神經(jīng)上皮中的細胞形態(tài)動力學(xué)。
單細胞形態(tài)類型分析揭示了發(fā)育中的
類器官內(nèi)形狀的轉(zhuǎn)變
研究人員利用多位點標記的質(zhì)膜、肌動蛋白、微管、核膜和組蛋白評估細胞形態(tài)變化在早期大腦類器官發(fā)育過程中對細胞的影響。通過開發(fā)的圖像分析流程：圖像預(yù)處理→亞細胞結(jié)構(gòu)分割→結(jié)構(gòu)預(yù)測→特征提取→解多通道→形態(tài)特征分析，揭示了兩個主要的核（組蛋白、層粘連蛋白）和細胞（肌動蛋白、微管、膜）結(jié)構(gòu)組。
通過高分辨率聚類，將結(jié)構(gòu)分組為形態(tài)類型，即具有相似形態(tài)特征（如體積、曲率、軸長的細胞簇，使用PAGA軌跡分析識別組織中的結(jié)構(gòu)變化梯度，量化了多能干細胞向早期神經(jīng)外胚層的過渡，基于細胞結(jié)構(gòu)形態(tài)和組織拓撲變化形成成熟的神經(jīng)上皮。
通過對每種基質(zhì)條件（基質(zhì)膠、瓊脂糖和無外源基質(zhì)）下，對每一天成像的類器官進行標記結(jié)構(gòu)的分割以及形態(tài)學(xué)分類分析，結(jié)果表明在沒有基質(zhì)膠作為外部細胞外基質(zhì)的情況下生成的類器官在組織拓撲上發(fā)生了變化，包含更大比例的非排列和非延長細胞，細胞形態(tài)類型的異質(zhì)性更高，并且未形成均勻的神經(jīng)外胚層和神經(jīng)上皮。
矩陣通過調(diào)節(jié) WNT 通路影響類器官的
形態(tài)發(fā)生和模式形成
為了理解在不同基質(zhì)條件（基質(zhì)膠、瓊脂糖、無矩陣）下生長的類器官中發(fā)展出的分子細胞狀態(tài)，我們對第 13 天的類器官進行了單細胞轉(zhuǎn)錄組分析，差異表達基因的基因本體分析顯示出多個信號通路的富集，包括WNT、Notch、FGF 和 Hippo 信號通路以及與肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)相關(guān)的基因。
基質(zhì)膠誘導(dǎo)的神經(jīng)外胚層的強烈形態(tài)變化，以及在無基質(zhì)條件下 WNT 和 Hippo 信號通路的上調(diào)，測試了YAP調(diào)節(jié)對類器官發(fā)育的影響。綜合證實了我們應(yīng)用含有外部基底膜豐富的 ECM 的 matrigel，導(dǎo)致腔體擴張并自我模式化為主要的頭側(cè)前腦區(qū)域，并且 YAP1 的激活和 WLS 表達水平的增加促進了發(fā)育中的神經(jīng)上皮的尾部化。
在對人類早期腦類器官的形態(tài)動力學(xué)研究中，Viventis LS2 Live光片顯微鏡以極低的光毒性，通過多視角、多位置、長時程的活細胞成像，展現(xiàn)腦類器官的整個發(fā)育過程。在單次長時程成像過程中，同時收集多個樣本在不同條件下的數(shù)據(jù)，結(jié)合自我開發(fā)的分析流程、單細胞轉(zhuǎn)錄組分析、信號通路探索分析，展示了YAP1 在基質(zhì)介導(dǎo)的形態(tài)發(fā)生和類器官模式化中發(fā)揮的作用。
總的來說，這一應(yīng)用案例為理解類器官發(fā)育的形態(tài)動力學(xué)提供了技術(shù)進步，提供了對基質(zhì)介導(dǎo)的神經(jīng)上皮信號通路的機制性見解，并為未來探索人類大腦發(fā)育過程中細胞外微環(huán)境鋪平了道路。
參考文獻：
1.Method of the Year 2017: Organoids. (2018). Nature Methods
2.Elke Gabriel et.al Human brain organoids assemble functionally integrated bilateral optic vesicles Cell Stem Cell 28, 1740–1757, October 7, 2021
3.Akanksha Jain et.al Morphodynamics of human early brain organoid development bioRxiv | August 21, 2023
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