整合單細(xì)胞RNA測序和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)破譯人類子宮腺肌癥的全面轉(zhuǎn)錄圖譜

圖1

2. 腺肌病中上皮細(xì)胞和特征亞群的特異性基因表達(dá)
我們首先利用結(jié)合scRNA-seq數(shù)據(jù)的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)展示了子宮腺肌癥的整體景觀。在腺肌病變中，上皮細(xì)胞被基質(zhì)細(xì)胞包圍，與異位子宮內(nèi)膜相比，異位病變表現(xiàn)出STEAP4+血管周圍細(xì)胞（PV STEAP4）的富集，這表明血管生成微環(huán)境可能有助于子宮腺肌癥的進(jìn)展（圖2A）。然后，將上皮細(xì)胞分為纖毛細(xì)胞亞組和非纖毛細(xì)胞亞組（圖2B）。盡管它們在不同區(qū)域（EnC, EnJ, EnD）的分布是一致的（圖2B），但它們的基因表達(dá)卻存在顯著差異（圖2C）。在EnC上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因，如基質(zhì)金屬肽酶7 （MMP7）、血小板衍生生長因子亞基A （PDGFA）、KRT23（角蛋白23）、DMBT1（在惡性腦腫瘤中缺失1）和CLDN4 (claudin 4)，在遷移、血管生成和增殖相關(guān)的過程中表現(xiàn)出富集（圖2C）。GO富集分析顯示，基因富集于“調(diào)節(jié)肌動蛋白絲聚合”、“正向調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移”以及“腫瘤壞死因子（TNF）信號通路”和“MAPK信號通路”（圖2D）。相反，在EnJ上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)的基因表現(xiàn)出與細(xì)胞生長和細(xì)胞基質(zhì)粘附相關(guān)的金屬硫蛋白1E （MT1E）、金屬硫蛋白1G （MT1G）和血紅素加氧酶1 （HMOX1）的顯著上調(diào)（圖2C和2D）。這些數(shù)據(jù)表明，子宮內(nèi)膜-子宮肌交界處的上皮細(xì)胞因基質(zhì)重塑而發(fā)生改變，病變中的細(xì)胞表現(xiàn)出遷移和增殖特征。

值得注意的是，通過將scRNA-seq整合到空間轉(zhuǎn)錄組中，我們發(fā)現(xiàn)富含亮氨酸的含有G蛋白偶聯(lián)受體5 （LGR5+）的細(xì)胞在EnC上皮細(xì)胞中顯著富集（圖2E）。為了驗證LGR5的表達(dá)，我們對不同組織的上皮細(xì)胞進(jìn)行了qRT-PCR。結(jié)果顯示，EnC中LGR5 mRNA表達(dá)水平明顯高于EnD（圖2F）。此外，免疫熒光（IF）染色分析表明，LGR5在EnC上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)（圖2G、2H和S2A）。我們通過免疫組化（IHC）染色進(jìn)一步驗證，發(fā)現(xiàn)LGR5主要表達(dá)在子宮腺肌癥EnC的上皮細(xì)胞中（圖2I和2J）。LGR5是成體干細(xì)胞的標(biāo)志物，據(jù)報道，表達(dá)LGR5的干細(xì)胞對子宮腺上皮的發(fā)育至關(guān)重要�；�因LGR5也被認(rèn)為是WNT信號通路的典型靶點。因此，我們假設(shè)LGR5+干細(xì)胞/祖上皮細(xì)胞作為異位病變的一個特征亞群，LGR5/WNT信號通路可能有助于子宮腺肌癥（圖2K）。SRY-box轉(zhuǎn)錄因子9 （SOX9）部分基因的表達(dá)，MSL1和MMP7與WNT信號通路相關(guān)的基因在EnC中顯著上調(diào)（圖2L）�？傊�，腺肌病的上皮細(xì)胞表現(xiàn)出獨特的基因表達(dá)譜，LGR5+細(xì)胞在異位病變中顯著存在，表明LGR5/WNT信號通路在疾病進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。
 

圖2

3. 子宮腺肌病的基質(zhì)細(xì)胞和特征亞群
重新聚集了基質(zhì)細(xì)胞，鑒定了5個基質(zhì)細(xì)胞亞群和2個成纖維細(xì)胞亞群（圖3A）。批量校正后，不同基質(zhì)亞群分布在子宮的不同區(qū)域（圖3B）。基質(zhì)簇0和3主要位于EnD（圖3B）。基質(zhì)簇0的特征是表達(dá)APCDD1（大腸息肉腺瘤病下調(diào)1）、同源盒A11 （HOXA11）和補(bǔ)丁（果蠅）同源1 (PTCH1)，在“細(xì)胞分化”和“WNT信號通路”方面富集，而基質(zhì)簇3富集泛素樣蛋白（Ubl）偶聯(lián)和蛋白折疊（圖3C和3D）。值得注意的是，基質(zhì)簇2是腺肌病變（EnC）特有的，其特征是表達(dá)與細(xì)胞生長、細(xì)胞遷移和脈管系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的ENPP2、PKIB、TM2B、ALCAM和FBXO32（圖3C、3D、3F）�；�質(zhì)簇4的特征是表達(dá)WFDC1、EEF1B2、SFRP5，并富集典型的細(xì)胞質(zhì)翻譯（圖3C、3D和S3A）。綜上所述，我們的研究顯示了子宮組織間質(zhì)細(xì)胞的異質(zhì)性。

由于基質(zhì)簇2被認(rèn)為是一個病變特異性亞群，我們首先通過qRT-PCR驗證了基質(zhì)簇2特異性表達(dá)的基因，包括ENPP2和PKIB。結(jié)果顯示，與對照組和子宮腺肌癥患者的EnD基質(zhì)細(xì)胞相比，這兩個基因在異位基質(zhì)細(xì)胞中顯著上調(diào)（圖3E）。此外，空間轉(zhuǎn)錄組顯示，PKIB+和ENPP2+基質(zhì)細(xì)胞在異位病變中獨特地分布在上皮細(xì)胞周圍（圖3G）。熒光原位雜交（FISH）和免疫熒光（IF）染色證實了基質(zhì)簇2的存在和組織學(xué)分布（圖3H-J）�？傊�，我們的研究結(jié)果揭示了子宮腺肌病中病變特異性基質(zhì)亞細(xì)胞類型，并發(fā)現(xiàn)PKIB，一種與細(xì)胞增殖和侵襲相關(guān)的基因，影響各種細(xì)胞過程，在該集群中顯著增加。該研究確定了子宮腺肌癥中5個間質(zhì)和2個成纖維細(xì)胞亞群，其中一個病變特異性間質(zhì)簇2表達(dá)增殖和侵襲相關(guān)的PKIB，可能與子宮腺肌癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。
 

圖3

4. 子宮腺肌癥基質(zhì)細(xì)胞與祖基質(zhì)細(xì)胞的分化軌跡
為了深入了解基質(zhì)分化，我們生成了基質(zhì)亞群的RNA速率圖，預(yù)測了三種發(fā)育軌跡（圖4A）。基質(zhì)簇4細(xì)胞位于擬時間軌跡的起始點，提示基質(zhì)簇4是基質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞。基質(zhì)簇4指向基質(zhì)0，然后是基質(zhì)3表示正常子宮內(nèi)膜路徑（EnD路徑），基質(zhì)簇4指向基質(zhì)2表示異位病變路徑（EnC路徑），基質(zhì)簇4指向基質(zhì)1表示子宮內(nèi)膜-子宮內(nèi)膜交界處路徑（EnJ路徑）（圖4C）。值得注意的是，3例子宮腺肌癥患者的軌跡方向完全一致（圖4B）。接下來，我們繪制了細(xì)胞亞群之間和沿擬時間軌跡的差異表達(dá)基因圖譜（圖4D）。在祖基質(zhì)細(xì)胞中檢測到SFRP5的顯著上調(diào)，主要定位于基質(zhì)簇4（圖4D和4E）。鑒于其作為WNT信號通路抑制因子的作用，該基因編碼一種蛋白激素，可能潛在地調(diào)節(jié)子宮腺肌癥發(fā)病機(jī)制。在EnD通路中，WNT信號通路相關(guān)基因（如APCDD1、VWC2、WNT5A、WNT4和子宮發(fā)育基因（包括HOXA10、HOXA11、FOXL2）上調(diào)。EnC通路中，ENPP2、PKIB、WNT16和NELL2的表達(dá)量為細(xì)胞級增加（圖4D和4E）。為了驗證路徑中的基因，我們通過qRT-PCR進(jìn)一步驗證了WNT16、APCDD1、VWC2的表達(dá)水平（圖4F）。為了進(jìn)一步確定基質(zhì)簇4的特征基因，我們發(fā)現(xiàn)WFDC1是最頂端的標(biāo)記基因，它與炎癥、修復(fù)和細(xì)胞遷移相關(guān)，主要在基質(zhì)簇4中表達(dá)（圖3C和4G）。通過空間轉(zhuǎn)錄組分析，WFDC1+細(xì)胞主要富集腺肌病的EnD、EnJ和EnC（圖4H）。因此，我們通過FISH和IHC染色進(jìn)一步驗證，發(fā)現(xiàn)WFDC1主要表達(dá)在子宮腺肌癥的EnC和EnJ區(qū)（圖4I-K）。綜上所述，間質(zhì)祖細(xì)胞在子宮腺肌病中向病變細(xì)胞或正常子宮內(nèi)膜分化的過程具有不同的軌跡，說明WFDC1+間質(zhì)祖細(xì)胞可能作為病變特異性間質(zhì)簇的前體細(xì)胞，在子宮腺肌病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。
 

圖4

5. 內(nèi)皮細(xì)胞多樣性和血管生成
內(nèi)皮細(xì)胞（EC）在EnC中明顯增加，這表明在腺肌病變中發(fā)生了血管生成（圖1G）。我們確定了7個EC亞群，它們在腺肌病組織中分布不同（圖5A、5B）。如EC -毛細(xì)血管簇主要分布在EnC、EnJ和EnM，對照組和子宮腺肌癥組相似。此外，基因表達(dá)分析顯示，不同腺肌病區(qū)免疫相關(guān)基因和血管生成相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)差異（圖5C和5E）。在EnJ中，與趨化因子相關(guān)的基因（CCL23、CCL21和免疫反應(yīng)（TNFSF9、CTSC）的表達(dá)增加（圖5D）。在EnD中，血管生成相關(guān)基因，如ARHGDIB 和GNAS主要上調(diào)（圖5E）。通過空間轉(zhuǎn)錄組觀察，在病變周圍分布的質(zhì)膜囊泡相關(guān)蛋白陽性（PLVAP+）細(xì)胞可以影響EC的通透性并調(diào)節(jié)血管通透性。此外，我們的研究還揭示了不同細(xì)胞類型中不同的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和ANGPT信號模式，表明復(fù)雜的血管生成環(huán)境（圖5F）。血管生成信號和新生血管在內(nèi)皮細(xì)胞亞群中發(fā)生改變。EC-tip響應(yīng)血管生成信號，遷移和增殖形成新的血管結(jié)構(gòu)，并分化為毛細(xì)血管內(nèi)皮、動脈內(nèi)皮和靜脈內(nèi)皮亞型。免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域1和EGF樣結(jié)構(gòu)域1的ANGPT和TIE1、FLT1、VEGFR1和VEGFR2在EC-tip細(xì)胞EnC中的上調(diào)表明血管生成活躍（圖5G）。此外，Notch信號的激活表明EC-尖端細(xì)胞成熟（圖5G）。此外，ANGPT- tie軸被認(rèn)為對血管生成至關(guān)重要，并且在子宮腺肌癥的EnC中觀察到ANGPTL、 ANGPT和VEGF信號的廣泛細(xì)胞間通訊（圖5H）。在EnC中，ANGPTL信號從nCili上皮細(xì)胞、肌球蛋白重鏈11 （MYH11+）血管周圍細(xì)胞和成纖維細(xì)胞釋放，并靶向內(nèi)皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和STEAP4+血管周圍細(xì)胞�？傮w而言，在腺肌病區(qū)發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞異質(zhì)性和血管生成相關(guān)的差異信號。異常的血管通透性和血管生成可能導(dǎo)致大量月經(jīng)出血等癥狀。
 

圖5

6. 子宮腺肌癥細(xì)胞連接異常
最后，我們使用CellPhoneDB和CellChat分析了腺肌瘤異位和異位子宮內(nèi)膜組織中細(xì)胞間的相互作用。在EnC中，基質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和EC之間的相互作用減少，而平滑肌細(xì)胞（SMCs）與其他細(xì)胞類型的相互作用增加（圖6A和6B）。腺肌病的EnD和EnC中富集了不同的細(xì)胞通訊信號通路模式（圖6C和6D）。在EnC中，PTN和腫瘤壞死因子樣凋亡弱誘導(dǎo)劑（TWEAK）是主要的輸出信號，主要由成纖維細(xì)胞和MYH11+血管周圍細(xì)胞分泌（6E和6F)。這些信號通路與細(xì)胞增殖、血管生成和免疫反應(yīng)有關(guān)，并促進(jìn)異位病變的進(jìn)展。相比之下，EnD在SPP1和HH途徑中富集，與子宮內(nèi)膜接受性和基質(zhì)細(xì)胞活性相關(guān)（圖6H）。

EnC和EnD在關(guān)鍵信號通路如WNTs、胰島素樣生長因子（IGFs）和TNF中差異表達(dá)（圖6G）。EnD中由增殖標(biāo)志物Ki-67 （MKI67+）細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和基質(zhì)分泌的WNTs和IGFs在EnC中減少。免疫細(xì)胞，特別是巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞的通訊也發(fā)生了變化，誘導(dǎo)TNF、CSF、LIFR和IL2信號通路。綜上所述，我們的發(fā)現(xiàn)顯示了腺肌病組織中通信模式的改變。觀察到信號通路的變化，包括與細(xì)胞增殖、血管生成和免疫反應(yīng)相關(guān)的信號通路。這表明子宮腺肌癥的微環(huán)境發(fā)生了動態(tài)變化，導(dǎo)致了其復(fù)雜的病理生理。
 

圖6

結(jié)論
子宮腺肌病是一種尚未完全了解的婦科疾病。為了解決這些空白，在本研究中，我們對覆蓋整個子宮所有重要區(qū)域的子宮腺肌病和對照樣本進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測序和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。這使我們能夠全面表征子宮腺肌癥的細(xì)胞異質(zhì)性，并闡明區(qū)域分子異質(zhì)性，特別是在關(guān)鍵的子宮內(nèi)膜-子宮內(nèi)膜交界處。我們確定了腺肌病病變特有的獨特上皮和基質(zhì)亞群，揭示了復(fù)雜的血管生成微環(huán)境，并描繪了改變的細(xì)胞間通訊。離散細(xì)胞群、異常信號程序和區(qū)域差異的識別促進(jìn)了我們對子宮腺肌癥發(fā)病機(jī)制中復(fù)雜分子景觀的理解。

我們的研究為子宮腺肌病的病理提供了開創(chuàng)性的見解。首先，我們建立了一個高分辨率的單細(xì)胞圖，首次闡明了連接區(qū)的異質(zhì)性。其次，本研究通過單細(xì)胞分析確定了腺肌病病變特異性的獨特上皮（LGR5+）和基質(zhì)（PKIB+）亞群。LGR5已被報道為成體干細(xì)胞的標(biāo)記物，并鑒定出WFDC1+基質(zhì)祖細(xì)胞群，可能作為病變特異性基質(zhì)細(xì)胞的前體。我們提供了化生和內(nèi)陷理論之間相互作用的見解。第三，確定的人群為精確診斷和治療提供了目標(biāo)。靶向侵襲性PKIB+基質(zhì)細(xì)胞或祖細(xì)胞LGR5+上皮細(xì)胞可能促進(jìn)靶向治療的發(fā)展。血管生成和免疫信號異常突出了新型抗血管生成和免疫調(diào)節(jié)療法的潛力。最終，這種集成的單細(xì)胞分析從根本上推進(jìn)并重塑了對子宮腺肌癥的理解。綜上所述，本研究闡明了子宮腺肌癥復(fù)雜的單細(xì)胞組合空間轉(zhuǎn)錄格局。該研究為化生和內(nèi)陷理論之間的相互作用提供了見解。

參考文獻(xiàn)：
Chen T, Xu Y, Xu X, Wang J, Qiu Z, Yu Y, Jiang X, Shao W, Bai D, Wang M, Mei S, Cheng T, Wu L, Gao S, Che X. Comprehensive transcriptional atlas of human adenomyosis deciphered by the integration of single-cell RNA-sequencing and spatial transcriptomics. Protein Cell. 2024 Jul 1;15(7):530-546. doi: 10.1093/procel/pwae012. PMID: 38486356; PMCID: PMC11214835.