單細胞RNA測序揭示兒童急性髓系白血病復發(fā)和緩解腫瘤微環(huán)境的變化

期刊：nature communication
影響因子：14.9
主要技術(shù)：單細胞轉(zhuǎn)錄組

導語
急性髓系白血�。ˋML）的微環(huán)境在不同亞型中展現(xiàn)出細胞和分子層面的顯著差異。本研究中，我們采用單細胞RNA測序技術(shù)（scRNA-seq）對兒童AML患者的骨髓樣本進行分析，這些樣本分別來自診斷（Dx）、誘導治療結(jié)束（EOI）和復發(fā)階段。通過對Dx和EOI階段的scRNA-seq數(shù)據(jù)以及TARGET AML項目的RNA-seq數(shù)據(jù)集進行深入分析，我們識別出7個與AML細胞密切相關(guān)的基因：CLEC11A、PRAME、AZU1、NREP、ARMH1、C1QBP和TRH。此外，我們還在一個獨立的數(shù)據(jù)集中驗證了這一基因特征集的準確性和可靠性。我們深度分析了在診斷（Dx）階段，與復發(fā)和持續(xù)完全緩解（CCR）相關(guān)的急性髓系白血�。ˋML）細胞展現(xiàn)出不同的細胞簇特征，以及與患者生存預后相關(guān)的差異表達基因。具體來說，在診斷（Dx）階段，復發(fā)風險較高的樣本中耗竭T細胞的數(shù)量較多，而與CCR相關(guān)的樣本中則顯示出較多炎性M1型巨噬細胞。治療結(jié)束后，在誘導結(jié)束（EOI）階段殘留的急性髓系白血病細胞中，我們觀察到脂肪酸氧化、腫瘤生長和干細胞相關(guān)基因的表達上調(diào)。此外，與復發(fā)樣本相關(guān)的治療后T細胞簇表現(xiàn)出MHC I類分子和T細胞調(diào)節(jié)基因表達的下調(diào)。本研究為兒童AML復發(fā)和CCR相關(guān)樣本進行了詳細的描述，進一步深化了我們對骨髓（BM）微環(huán)境狀態(tài)的理解。

文章亮點
1.文章利用單細胞RNA測序技術(shù)對兒童急性髓系白血�。ˋML）的骨髓樣本進行了分析，這使得研究者能夠深入了解疾病在不同階段的細胞和分子差異。

2.基因標志物的發(fā)現(xiàn)：研究者識別出一個與AML相關(guān)的7個基因標志物（CLEC11A, PRAME, AZU1, NREP, ARMH1, C1QBP, TRH），這一發(fā)現(xiàn)有助于區(qū)分AML細胞。

主要技術(shù)
單細胞轉(zhuǎn)錄組

研究思路

研究結(jié)果
1.臨床樣本和研究設(shè)計
從亞特蘭大兒童保健中心(CHOA)獲得的冷凍骨髓（BM）樣品，使用10x平臺進行了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序。共有20例患者的31個骨髓（BM） 樣本。在31個 BM 樣品中，19個診斷(Dx) (1D-14D，16D-20D)，10個誘導結(jié)束(EOI )(3E，5E，6E，14E-20E)，2個復發(fā)(Rel)(5R，6R)。因此，有9對配對的 Dx 和 EOI 樣品，其中4個用于開發(fā)7個基因標志物(患者3,5,6和14) ，5個用于驗證7個基因標志物(患者16-20)。兩名患者(5和6)在診斷(Dx)，誘導結(jié)束(EOI)和復發(fā)(Rel)采集樣本。

2.單細胞分析鑒定了分化細胞和異質(zhì)性患者特異性 AML 急性髓系白血病細胞
對來自四個配對的診斷(Dx)，誘導結(jié)束(EOI)樣品(患者3,5,6,14)的scRNA-seq 數(shù)據(jù)進行比較分析。經(jīng)過質(zhì)控之后，對19,350個細胞進行無監(jiān)督分析聚類為14個細胞簇(圖1a)。根據(jù)分化免疫細胞和基質(zhì)細胞的marker基因的表達，對其中 11 個簇進行手動注釋（圖1b），其他細胞群被推定為急性髓系白血病細胞簇（圖1b）。分化的免疫細胞包括 T 細胞、B 細胞 、單核細胞 、巨噬細胞、單核細胞/巨噬細胞、漿細胞樣樹突狀細胞、前 B/漿細胞和中性粒細胞 （圖1b）。這些急性髓系白血病細胞簇具有患者特異性，反映了急性髓系白血病細胞之間的異質(zhì)性（圖1c）。UMAP分析顯示，三個典型急性髓系白血病細胞簇在Dx樣本中過度表達，EOI樣本中有更多的分化細胞（圖1d）。
 

圖1 單細胞轉(zhuǎn)錄組識別AML中異質(zhì)性的急性髓系白血病細胞簇

3. AML急性髓系白血病細胞特征的鑒定
成功區(qū)分急性髓系白血病（AML）細胞和非急性髓系白血病細胞簇之后，我們利用來自四名患者（3、5、6和14）的配對診斷（Dx）和誘導結(jié)束（EOI）樣本的整合單細胞RNA測序（scRNA-seq）數(shù)據(jù)，開發(fā)出特異性針對AML細胞的基因集。我們對Dx階段富集的AML細胞簇（表現(xiàn)為MPO+、CD34+、AZU+）與EOI階段富集的非非急性髓系白血病細胞簇（分別對應Dx和EOI時間點）進行了差異表達基因（DEG）分析（圖1d），并鑒定出232個顯著的DEGs。

為了進一步篩選和細化這一基因列表，我們引入了TARGET AML-1數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包含了不同急性髓系白血病細胞比例的Dx骨髓樣本以及治療后的EOI骨髓樣本。在TARGET AML-1的Dx樣本中，根據(jù)疾病負擔的程度，我們將樣本分為三個區(qū)間：超過60%、30-60%、低于30%的急性髓系白血病細胞比例。與EOI樣本相比較，我們發(fā)現(xiàn)在高急性髓系白血病細胞比例樣本（超過60%）和低急性髓系白血病細胞比例樣本（低于30%）中，共有44個基因顯著過表達。隨后，我們對患者3、5、6、14的scRNA-seq數(shù)據(jù)進行了基因表達分析，確認這44個基因在AML細胞中具有特異性，與EOI階段的非急性髓系白血病細胞相比，在Dx階段的AML急性髓系白血病細胞中表達水平更高（見圖1e）。

在 44 個基因中，選擇了 20 個在 Dx AML 細胞中表現(xiàn)出特異性過表達的基因（與治療后非AML細胞相比）進行進一步評估。與 TARGET AML-1 數(shù)據(jù)集中 <30% 的急性髓系白血病細胞和 EOI 樣本相比，所選 20 個基因在 >60% 和 30-60% 的急性髓系白血病細胞樣本中的表達更高（圖 2a）。這些在急性髓系白血病細胞中過表達的基因包括與抗凋亡相關(guān)的基因（如PRAME、MSLN、CITED4）、造血前體細胞生長因子（如CLEC11A）、細胞增殖相關(guān)基因（如CAPRIN1），以及PPARα誘導的增殖和腫瘤生長相關(guān)基因（如FABP5）。NREP和CLEC11A兩個基因被確認與AML急性髓系白血病細胞密切相關(guān)。在配對的Dx和EOI樣本中鑒定的三個急性髓系白血病細胞簇中，這兩個急性髓系白血病細胞相關(guān)基因（NREP和CLEC11A）顯示出高表達（圖2b），其表達水平相當于或優(yōu)于目前臨床上用于鑒定AML急性髓系白血病細胞的基因（如CD34、MPO、CD33和CD56/NCAM1）。

盡管在急性髓系白血病細胞比例大于60%和30-60%的Dx樣本中，這20個基因的表達差異不大，但與急性髓系白血病細胞比例低（小于30%）和治療后EOI樣本相比，差異更為顯著（圖2a、c）。此外，在20個AML細胞相關(guān)基因中，大多數(shù)（14個）在TARGET AML-1數(shù)據(jù)集中與總體生存率（OS）顯示出顯著相關(guān)性（見圖2d）。

為了更精確地區(qū)分AML急性髓系白血病細胞和其他細胞，我們采用了監(jiān)督機器學習方法——支持向量機（SVM）。SVM分析鑒定出7個基因（CLEC11A、PRAME、AZU1、NREP、ARMH1、C1QBP、TRH），它們能夠以0.968的AUC值區(qū)分AML相關(guān)的急性髓系白血病細胞和非急性髓系白血病細胞（見圖2e）。這一發(fā)現(xiàn)為AML的診斷和治療提供了新的分子標記。

基于7個基因特征的模塊評分有效地區(qū)分了潛在的AML急性髓系白血病細胞與非急性髓系白血病細胞。急性髓系白血病細胞簇 (MPO+ 和 AZU1+ ) 在 Dx (5D, 6D) 和 Rel (5R, 6R) 樣本中占主導地位，而在 EOI (5E, 6E) 樣本中則最少 (圖 2f, g)。接下來，我們評估了AML急性髓系白血病細胞相關(guān)7個基因特征在區(qū)分急性髓系白血病細胞與正常HSC和健康BM樣本中的特異性。我們通過整合多個數(shù)據(jù)集，包括AML患者的診斷和結(jié)束治療樣本、健康成年人的骨髓單細胞RNA測序數(shù)據(jù)以及公開的造血干細胞數(shù)據(jù)集，利用7個基因特征對AML急性髓系白血病細胞進行了特異性分析。結(jié)果展示MPO+，AZU+，CD38+這些基因在AML急性髓系白血病細胞中的顯著表達(圖2h)，模塊評分顯示AML急性髓系白血病細胞與非急性髓系白血病細胞以及健康對照樣本之間的顯著差異(圖2I)，突出了7個基因特征在識別和區(qū)分AML急性髓系白血病細胞中的潛力。這些結(jié)果不僅證實了7個基因特征的特異性，也為AML的診斷和治療提供了新的分子標記。

為了進一步驗證7個特征基因在區(qū)分急性髓系白血病細胞與非急性髓系白血病細胞方面的性能，我們分析了兩個獨立的scRNA-seq數(shù)據(jù)集。數(shù)據(jù)集一由來自另外5名急性白血病患者（患者16-20）的配對Dx和EOI樣本組成。UMAP揭示了Dx富集的集群（0、2、5、6、10、11、13、14、17），這些集群在治療后EOI樣本中急劇減少。對7個特征基因進行的基于SVM的分析，用于區(qū)分AML急性髓系白血病細胞與非急性髓系白血病細胞，其結(jié)果為0.78（圖2 j）。第二個數(shù)據(jù)集包含八名兒童AML患者的樣本，通過整合分析和額外的CNA分析，我們成功識別出AML急性髓系白血病細胞簇，并得到0.809的AUC值（圖2k）。這些高AUC值進一步證實了7個特征基因在AML急性髓系白血病細胞特異性中的有效性。
 

圖2 從異質(zhì)性AML急性髓系白血病細胞中開發(fā)出急性髓系白血病細胞前體特征標記

4.對比分析診斷復發(fā)和持續(xù)完全緩解（CCR）相關(guān)的AML急性髓系白血病細胞
為了深入分析診斷階段的AML急性髓系白血病細胞和免疫細胞的特征，我們對14個在診斷時收集的骨髓樣本進行了研究，其中包括6個復發(fā)患者的樣本（編號1D至6D）和8個持續(xù)完全緩解（CCR）患者的樣本（編號7D至14D）。經(jīng)過嚴格的質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)處理和標準化流程后，我們對28,181個細胞聚類為15個細胞簇。利用基于7個基因的急性髓系白血病細胞特征模塊評分系統(tǒng)，我們鑒定出14,166個細胞為AML急性髓系白血病細胞，這些細胞主要分布在第1、3、5、9、10、12、13簇中。而其余的14,015個細胞則被歸類為非急性髓系白血病細胞簇。

為了深入探究AML急性髓系白血病細胞的特性，我們對這些細胞進行了篩選和重新聚類。通過UMAP分析，我們發(fā)現(xiàn)無論是復發(fā)還是持續(xù)完全緩解（CCR）的急性髓系白血病細胞，在轉(zhuǎn)錄層面上都展現(xiàn)出較高的相似性（見圖3a）。在AML患者中，不同患者的急性髓系白血病細胞基因表達模式存在顯著的異質(zhì)性（見圖3b）。與CCR相關(guān)的細胞簇（第1、3、4簇）和與復發(fā)相關(guān)的細胞簇（第0、2、7、13簇）在差異表達基因（DEG）分析中具有較大的差異。與CCR相關(guān)的細胞簇中，MPO、IFITM3、TRH、PRTN3和HLA-DPA1等基因表達水平較高，而與復發(fā)相關(guān)的細胞簇中，CRIP1、FLNA和RFLNB/FAM101B等基因表達水平升高（圖3c）。生存分析顯示，復發(fā)相關(guān)細胞簇中過表達的FLNA和RFLNB/FAM101B基因與較差的總生存（OS）顯著相關(guān)（見圖3d）。相對地，CCR相關(guān)細胞簇中過表達的基因，例如MPO和TRH，與較好的OS顯著相關(guān)（圖3d）。

基于已知和預測的蛋白-蛋白相互作用的交互式弦網(wǎng)絡分析，我們識別出FLNA作為RFLNB/FAM101B的關(guān)鍵相互作用蛋白。另一個被識別的RFLNB/FAM101B的相互作用蛋白是WDFY4，它在調(diào)節(jié)經(jīng)典樹突狀細胞介導的病毒和腫瘤抗原交叉呈遞中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Kaplan-Meier圖顯示，RFLNB/FAM101B和WDFY4基因的高表達與較差的OS和較短的無事件生存期（EFS）顯著相關(guān)。此外，對復發(fā)相關(guān)Dx急性髓系白血病細胞DEGs的通路分析揭示了包括“RhoGDI信號”、“eNOS信號”、“雄激素信號”和“蛋白激酶A信號”在內(nèi)的多個通路的顯著激活（P<0.01）（圖3e）。這些復發(fā)相關(guān)急性髓系白血病細胞中JAK/STAT信號、HIF1-α、干擾素和神經(jīng)炎癥信號相關(guān)的通路被顯著抑制（圖3e）。進一步的基于上游調(diào)控因子的系統(tǒng)生物學分析發(fā)現(xiàn)，在復發(fā)相關(guān)的急性髓系白血病細胞中，一個與細胞生長和增殖相關(guān)的主調(diào)控因子（如MTA1, NKX2.3, TCF3）的內(nèi)聚網(wǎng)絡被激活（見圖3f）。
 

圖3 復發(fā)樣本的AML急性髓系白血病細胞轉(zhuǎn)錄與CCR樣本具有差異

5.與Dx復發(fā)相關(guān)的非急性髓系白血病細胞簇，耗竭T細胞的富集和M1型巨噬細胞減少
接下來，我們對診斷Dx時骨髓樣本中的非急性髓系白血病細胞進行了深入分析。UMAP揭示了復發(fā)和CCR相關(guān)樣本中細胞類型（特別是T細胞和單核細胞/巨噬細胞）的分布差異（圖4a）。為了了解特定亞型的T細胞是否與AML復發(fā)/CCR相關(guān)，T細胞分為11個不同的亞簇（圖4c）。結(jié)果表明，AML急性髓系白血病細胞對不同的幼稚和激活T細胞亞簇具有不同反應（圖4d）。幼稚T細胞（CCR7+，LEF1+，TCF7+）亞簇2、4和7顯著表達細胞毒性T細胞標記物（即CD8）。亞簇5、6、9、10和11是表達CCL5、KLRB1、KLRD1、GZMH、CD69和CD44的激活T細胞簇（圖4C）。復發(fā)和CCR相關(guān)樣本的比較分析顯示，前者的T細胞百分比顯著更高（圖4e）。此外，基于ssGSEA評分的T細胞耗竭估計顯示，復發(fā)相關(guān)樣本中耗竭T細胞的比例顯著高于CCR相關(guān)樣本（圖4e）。在CCR相關(guān)的T細胞亞群中觀察到更多顯著的幼稚T細胞（CCR7，LEF1，TCF7）（圖4e）。對包含復發(fā)相關(guān)亞簇（3，5，6）和CCR相關(guān)亞簇（7，8，10）進行DEGs分析（圖4f）。復發(fā)相關(guān)簇的上調(diào)DEGs的通路分析顯示多個免疫調(diào)節(jié)通路的顯著上調(diào)，包括Th1通路、鈣誘導的T淋巴細胞凋亡，以及T細胞耗竭通路的上調(diào)和PD-1與PD-L1癌癥免疫治療通路的下調(diào)（圖4g）。這些結(jié)果表明，復發(fā)和CCR相關(guān)的特定T細胞亞型的富集可能在治療后的結(jié)果中發(fā)揮作用。
 

圖4 Dx樣品免疫微環(huán)境分析

6. CCR 相關(guān)樣本中富含炎癥單核細胞/巨噬細胞
對Dx非急性髓系白血病細胞(來自患者樣本1-14)的集中分析確定了三種單核細胞/巨噬細胞，這些亞群在持續(xù)完全緩解（CCR）患者和復發(fā)患者的樣本中比例存在顯著差異(圖5a)。簇1和2富集了與CCR相關(guān)的樣本，而簇6僅有復發(fā)相關(guān)的樣本（圖5a）。與復發(fā)相關(guān)樣本相比，MCR相關(guān)樣本具有更多顯著的M1巨噬細胞（圖5 b）。在更多CCR相關(guān)樣本（簇1、2）和復發(fā)相關(guān)樣本（簇6）的DEGs分析中，發(fā)現(xiàn)前者上調(diào)了S100A炎癥基因家族、蛋白酶抑制劑、CST3和先天免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)因子CTSS（圖5c）。使用Dx CCR相關(guān)樣本DEGs進行的基因調(diào)節(jié)因子分析顯示，與M1型巨噬細胞極化相關(guān)的多個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子上調(diào)，F(xiàn)OS、TREM1、CD44和IL1B，以及與炎癥反應相關(guān)的NFKB2被激活（圖5d）。分析還識別了下調(diào)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，包括與AML進展相關(guān)的SAMHD1和SATB1（圖5d）。SAMHD1已被證明通過抑制NF-kβ和干擾素途徑在抑制先天免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。對關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子 FOS、TREM1、NFKB2 和 NFKBIA 基因表達水平的評估表明，它們在CCR相關(guān)樣本中表達較高，而在復發(fā)相關(guān)樣本中 CAT 和 SAMHD1 表達較高（圖 5e）。
 

圖5診斷時CCR相關(guān)樣本顯示炎癥單核細胞/巨噬細胞富集

7. EOI治療后殘留急性髓系白血病細胞群的特征
治療后 EOI 樣本 BM 微環(huán)境的表征對于揭示臨床中的急性髓系白血病細胞和非急性髓系白血病細胞狀況至關(guān)重要。為了識別 EOI 殘留急性髓系白血病細胞我們對四對配對的診斷（Dx）和結(jié)束治療（EOI）樣本（患者3、5、6、14）以及一個EOI樣本（患者15，其Dx樣本不可用）進行了整合數(shù)據(jù)分析。Dx 和 EOI 樣本與 Dx 樣本中富集的簇 4、6 和 8 能夠很好地整合在一起（圖6a）。進一步分析顯示，這三個Dx富集的簇由來自各個患者的細胞組成。這些Dx富集的簇（4、6、8）表現(xiàn)出7個特征基因的過表達，被指定為AML癌性急性髓系白血病細胞簇。在急性髓系白血病細胞簇中觀察到一小部分細胞來自EOI樣本（約占Dx樣本的6%）。為了確定治療后殘留腫瘤細胞的轉(zhuǎn)錄情況，我們對Dx急性髓系白血病細胞和治療后EOI殘留急性髓系白血病細胞進行了差異表達基因（DEGs）分析（圖6b）。EOI殘留急性髓系白血病細胞表現(xiàn)出與腫瘤生長和不良預后相關(guān)的多個基因的過表達，包括HOPX、SELENOP/SEPP1和FAM30A/C1orf110 53-55。進一步的基因集富集途徑分析顯示，在治療后EOI殘留急性髓系白血病細胞中，包括肌肉收縮、脂肪酸ω氧化和PPARα等多個途徑顯著上調(diào)（圖6c）。此外，對EOI殘留急性髓系白血病細胞中的DEGs進行的上游調(diào)節(jié)因子分析顯示，與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的多個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子被激活，包括SOX4、STAT3和TGFB1（圖6d）�？傊�，與調(diào)節(jié)治療后EOI殘留急性髓系白血病細胞的骨髓微環(huán)境相關(guān)的基因和途徑的差異調(diào)控可能導致AML患者的總生存期縮短和無病生存期降低。
 

圖6 結(jié)束治療（EOI）樣本的殘留急性髓系白血病細胞具有不同轉(zhuǎn)錄特征

8.復發(fā)相關(guān)的 EOI 樣本顯示 T 細胞增多，單核細胞/巨噬細胞減少
為了檢查EOI樣本中的非急性髓系白血病細胞，我們從上述Dx、EOI數(shù)據(jù)集中單獨選擇了EOI樣本中的細胞（15,070個單細胞），并對它們進行了重新聚類（圖7a）。臨床組（CCR 和復發(fā)）的典型免疫細胞（T 細胞、NK 細胞和巨噬細胞/單核細胞）的分布發(fā)生了改變（圖 7a）。復發(fā)和 CCR 相關(guān)的非急性髓系白血病細胞簇在 EOI 中顯示出與 Dx 中相似的模式，即復發(fā)相關(guān)樣本中 T 細胞的富集程度更高，CCR 相關(guān)樣本富集簇中單核細胞和巨噬細胞的比例更高（圖 7b、c）。進一步的M1和M2巨噬細胞富集分析顯示，在MCR EOI樣本中，炎癥性M1巨噬細胞占主導地位，在復發(fā)相關(guān)的EOI樣本中，M2巨噬細胞明顯富集（圖7 d）。T細胞形成三個不同的簇，即幼稚T細胞-1、幼稚T細胞-2和NK/T細胞群（圖7a）。幼稚T細胞-2簇在復發(fā)相關(guān)EOI樣本中表現(xiàn)出顯著富集（圖7 e）。Th1、Th2、鈣誘導的T細胞凋亡、T 輔助細胞中的 CD28 信號傳導和整合素通路相關(guān)的通路下調(diào)（圖 7f）。
 

圖7 EOI非急性髓系白血病細胞分析顯示，復發(fā)患者和持續(xù)完全緩解（CCR）患者的樣本呈現(xiàn)出不同的模式

參考文獻：
Mumme H, Thomas BE, Bhasin SS, Krishnan U, Dwivedi B, Perumalla P, Sarkar D, Ulukaya GB, Sabnis HS, Park SI, DeRyckere D, Raikar SS, Pauly M, Summers RJ, Castellino SM, Wechsler DS, Porter CC, Graham DK, Bhasin M. Single-cell analysis reveals altered tumor microenvironments of relapse- and remission-associated pediatric acute myeloid leukemia. Nat Commun. 2023 Oct 5;14(1):6209. doi: 10.1038/s41467-023-41994-0. PMID: 37798266; PMCID: PMC10556066.