線性多核苷酸借電穿孔增強真核細胞轉(zhuǎn)染

摘要：

本文研究了通過電穿孔法使用線性多核苷酸增強真核細胞轉(zhuǎn)染的效率和效果。實驗采用威尼德電穿孔儀，利用優(yōu)化后的電穿孔參數(shù)，成功在人類造血細胞，特別是樹突細胞（DC）中實現(xiàn)高效基因遞送。該方法優(yōu)于傳統(tǒng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和質(zhì)粒cDNA電穿孔，為基因治療、疫苗開發(fā)和免疫治療提供了有力工具。

引言：

基因遞送是基因治療、疫苗開發(fā)和免疫治療中的關鍵環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)方法如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和質(zhì)粒cDNA電穿孔雖已廣泛應用，但存在轉(zhuǎn)染效率低、細胞毒性大等問題。線性多核苷酸作為基因遞送的載體，具有穩(wěn)定性高、易于合成和修飾等優(yōu)點。然而，如何高效地將線性多核苷酸遞送到真核細胞中，仍是當前研究的熱點和難點。

電穿孔法作為一種物理轉(zhuǎn)染方法，通過施加短暫的高壓電脈沖，在細胞膜上形成瞬時微孔，使帶電荷的分子如DNA、RNA等能夠進入細胞內(nèi)。與其他轉(zhuǎn)染方法相比，電穿孔法具有操作簡便、適用范圍廣、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點。本研究旨在通過優(yōu)化電穿孔參數(shù)，使用線性多核苷酸作為載體，增強真核細胞的轉(zhuǎn)染效率和效果，為基因治療、疫苗開發(fā)和免疫治療提供新的策略和方法。

材料與方法：

1. 實驗材料：

   • 細胞：人類外周血單核細胞（PBMC）、單核細胞衍生的樹突細胞（Mo-DC）。
   • 線性多核苷酸：增強型綠色熒光蛋白（EGFP）mRNA。
   • 試劑：某試劑IMDM培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基、Optimix培養(yǎng)基、電穿孔緩沖液、成熟刺激劑（IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2等）。
   • 儀器：威尼德電穿孔儀、流式細胞儀（FACS）。

2. 實驗方法：

   • 細胞培養(yǎng)與分化：從新鮮血液中分離PBMC，用IMDM培養(yǎng)基洗滌后，用電穿孔洗滌緩沖液洗滌，并以一定密度重新懸浮在Opti-MEM或Optimix培養(yǎng)基中。對于Mo-DC的分化，將PBMC在補充了GM-CSF和IL-4的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6-7天。
   • 電穿孔轉(zhuǎn)染：在電穿孔前，將EGFP mRNA添加到細胞中，混合均勻后，將細胞懸浮液轉(zhuǎn)移到威尼德電穿孔儀的樣品池中。設置合適的電穿孔參數(shù)（如電壓、脈沖時間、電容等），觸發(fā)電穿孔。
   • 細胞成熟與檢測：對于Mo-DC，在電穿孔后，通過添加成熟刺激劑誘導其成熟。在轉(zhuǎn)染后不同時間點，使用流式細胞儀檢測EGFP的表達水平和細胞存活率。

實驗結果：

1. 轉(zhuǎn)染效率：

   實驗結果表明，通過優(yōu)化電穿孔參數(shù)，本研究成功在人類造血細胞，特別是Mo-DC中實現(xiàn)了高效基因遞送。在不成熟的Mo-DC中，使用400V的電壓和500μs的脈沖時間，轉(zhuǎn)染效率可達4%以上。進一步提高電壓至600V，轉(zhuǎn)染效率有所增強，但細胞存活率略有下降。

2. 細胞存活率：

   電穿孔后，細胞存活率受到一定影響。然而，通過優(yōu)化電穿孔參數(shù)和細胞培養(yǎng)條件，本研究成功地將細胞死亡率控制在較低水平。在電穿孔后96小時，即使使用600V的電壓，死亡細胞數(shù)量也僅為大約16%。

3. 基因表達與細胞成熟：

   在轉(zhuǎn)染后不同時間點，通過流式細胞儀檢測EGFP的表達水平。結果表明，EGFP在Mo-DC中成功表達，且表達水平隨時間逐漸增加。同時，通過添加成熟刺激劑，成功誘導了Mo-DC的成熟。成熟后的Mo-DC具有更強的轉(zhuǎn)基因表達能力和更低的細胞死亡率。

4. 冷凍保存與復蘇：

   實驗還探索了轉(zhuǎn)染后的Mo-DC的冷凍保存與復蘇效果。結果表明，在電穿孔后18小時冷凍的不成熟的Mo-DC在解凍后能夠很好地存活并表達EGFP。然而，在解凍后24小時，與在電穿孔后已培養(yǎng)了48小時的未冷凍對照相比，冷凍培養(yǎng)物具有高水平的細胞死亡率。相比之下，成熟的Mo-DC比冷凍的不成熟Mo-DC更好地從解凍過程中存活下來。

討論：

1. 電穿孔參數(shù)優(yōu)化：

   電穿孔參數(shù)是影響轉(zhuǎn)染效率和細胞存活率的關鍵因素。本研究通過優(yōu)化電壓、脈沖時間、電容等參數(shù)，成功在人類造血細胞中實現(xiàn)了高效基因遞送。結果表明，適當?shù)碾妷汉兔}沖時間可以顯著提高轉(zhuǎn)染效率，但過高的電壓會導致細胞死亡率增加。因此，在實際應用中需要根據(jù)細胞類型和實驗需求選擇合適的電穿孔參數(shù)。

2. 細胞類型與分化狀態(tài)：

   不同細胞類型和分化狀態(tài)對電穿孔轉(zhuǎn)染的效率和效果具有顯著影響。本研究發(fā)現(xiàn)，在人類造血細胞中，Mo-DC具有較高的轉(zhuǎn)染效率和較低的細胞死亡率。此外，不成熟的Mo-DC在轉(zhuǎn)染后更容易誘導成熟，而成熟的Mo-DC則具有更強的轉(zhuǎn)基因表達能力和更低的細胞死亡率。這些結果為后續(xù)研究和應用提供了重要參考。

3. 基因治療與免疫治療：

   本研究為基因治療、疫苗開發(fā)和免疫治療提供了新的策略和方法。通過電穿孔法將線性多核苷酸遞送到真核細胞中，可以實現(xiàn)高效基因表達和功能調(diào)控。這對于治療遺傳性疾病、感染性疾病和癌癥等具有重要意義。同時，該方法還可以用于制備基于DC的腫瘤疫苗和免疫治療試劑，為癌癥治療提供新的途徑和手段。

4. 創(chuàng)新與應用前景：

   本研究在電穿孔轉(zhuǎn)染技術方面取得了重要創(chuàng)新。通過優(yōu)化電穿孔參數(shù)和使用線性多核苷酸作為載體，成功實現(xiàn)了高效基因遞送和細胞功能調(diào)控。該技術具有操作簡便、適用范圍廣、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點，在基因治療、疫苗開發(fā)和免疫治療等領域具有廣闊的應用前景。